总三萜的分光光度测定法

本方法适用于灵芝制品(灵芝孢子粉、灵芝孢子油)中总三萜(triterpenes)含量测定。

1．方法

提要灵芝孢子中含有一百二十多种三萜类化合物，其结构十分复杂，要分离获得高纯度具有代表性的三萜化合物对照品技术难度大，因此，对于总三萜化合物含量的常规测定方法，目前仍以在自然界广泛存在的三萜化合物熊果酸为对照品，以分光光度法测定。

由于熊果酸与三萜类化合物的分子结构中均有相似的官能团结构，在特定的显色剂作用下，在548nm处显示相同的吸收特征，本法测得的含量实际为总三萜化合物含量，而非单一熊果酸含量，对该含量的测定结果以总三萜化合物表示。

2．主要仪器

(1)分光光度计。

(2)离心机(3000r／min)。

(3)旋涡混合器。

(4)超声波提取器。

(5)水浴锅。

3．试剂

实验用水为双蒸水，所有试剂为分析纯级别。

(1)三氯甲烷。

(2)冰醋酸。

(3)高氯酸。

(4)乙酸乙酯。

(5)香草醛：5％香草醛冰醋酸溶液(m／V)。

(6)熊果酸：Sigma公司，含量97％。准确称取熊果酸标准品11．7mg，置于100ml容量瓶中，用乙酸乙酯溶解，并定容至100ml，配成0．117mg／ml的标准贮备液。

4．测定步骤

(1) 灵芝孢子粉类样品：准确称取均匀的样品0．3～0．5g，置于50ml容量瓶中，加约30ml氯仿，置超声波提取器中强力超声波提取30min，取出冷却至室温，并加氯仿至刻度，摇匀，取上清液0．3~0．5ml(若提取液混浊可过滤)置于10ml比色管中，于60℃水浴中蒸干(或加氮气吹干)，然后加入0．4ml 5％香草醛冰醋酸溶液，混匀，加1．0ml高氯酸，混匀，在60℃水浴中加热15min后移入冰浴中冷却，并加入冰醋酸5ml，混匀后置室温下，在15～30min内，在分光光度计548nm处测定并记录吸光度值。

(2) 灵芝孢子油类样品：准确称取灵芝孢子油类样品100mg左右，置于50ml容量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容到刻度，混匀后吸取0．1～0．3ml置于lOml比色管中，同上法测定。

(3) 标准曲线的绘制：分别吸取熊果酸标准溶液0ml、0．1ml、0．2ml、0．3ml、0．4ml、0．5ml(相当于熊果酸0～58.5μg)，置于10ml比色管中，于60℃水浴中蒸干(或加氮气吹干)，同上法测定，并分别记录各吸光度值，以熊果酸质量为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线图。

熊果酸标准曲线

5．结果计算

总三萜化合物(以熊果酸计，mg／100g)=(A1×V1×100)/(m×V2×1000)

式中A1——样品测定液中比色相当于熊果酸的量(μg)；

V1——样品测定液体积(ml)；

m——样品质量(g)；

V2——测定用样品测定液体积(ml)；

1000——μg换算成mg的换算系数。

6．注释

(1) 香草醛一冰醋酸、高氯酸比色法是测定三萜类化合物常用的方法，但其影响因素较多，尤其是对选择何种标准品(灵芝酸B、熊果酸、齐墩果酸)、试剂的用量、反应时温度以及反应后放置时间等因素影响较为显著，故在实验中应严格控制反应条件，才能得到较为稳定及重现性好的结果。

(2) 由于保健食品配方组成的复杂性，提取溶剂可在氯仿、无水乙醇中选择，最好能做预实验，因不同组方的保健品用无水乙醇提取结果会比氯仿高。

(3) 本方法线性范围为11．7～58．5μg／ml，y=12．991x一0．0274，r=0．9993。

(4)本方法平均回收率为96．5％。

(5)精密度RSD=3．5％(17,=8)。

(6)方法学认证：经选择不同的测定波长(540—552nm)、不同的显色剂用量(0．1~0．6ml)、不同的高氯酸用量(0．6～1．4ml)、不同的水浴反应温度(40℃～80℃)和不同的时间段显色稳定性(5～100min)实验，以上述操作的反应条件为最佳。

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