维生素C的高效液相色谱测定法

本方法适用于保健食品营养补充剂中维生素C(ascorbic acid)的测定。

本方法维生素C的检出限为8ng。

1．方法提要

目前维生素c测定的国家标准方法只有GB／T5009．86—2003“蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定”(荧光法和2，4一二硝基苯肼法)，该法只适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。天然食品中的抗坏血酸是以蛋白质结合的形式存在，包含有还原型抗坏血酸和脱氢型抗坏血酸，样品用草酸提取后经活性炭将还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，再与有关试剂进行荧光(显色)反应，操作步骤繁琐。对于营养补充剂维生素C的测定，可直接用草酸提取后用HPLC检测。

2．仪器

高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波提取器等。

3．试剂

(1)0．1％草酸(AR)溶液(W／V)。

(2)维生素C对照品：中国药品生物制品检定所，供含量测定用。

(3)维生素C标准使用液：准确称取维生素C对照品0．0815g，置于100ml棕色容量瓶中，用0．1％草酸溶解并稀释至刻度(为0．815mg／ml)，再分别吸取0．2ml、0，5ml、1．0ml、1．5ml、2．0ml，分别置10ml棕色容量瓶中，用0．1％草酸稀释至刻度，配制成16．3μg／ml、40．8μg／ml、81．5μg／ml、122．3μg／ml、163．0μg／ml的标准使用液。

4．操作步骤

(1) 样品处理：准确称取经研磨成粉末状的均匀样品约1．000g(含维生素C30～40mg)，置于100ml棕色容量瓶中，加约60ml 0．1％草酸溶液，置于超声波提取器中超声波提取5min，冷却至室温，再加0．1％草酸溶液至刻度，摇匀，静置，取上清液，用0．1％草酸溶液稀释5倍，摇匀后经0．45μm微孔滤膜过滤后，进样测定。液体样品可直接用0．1％草酸稀释至合适的浓度，经0．45μm微孔滤膜过滤后进样测定。

(2) 标准曲线的绘制：分别进样10μl各标准使用液，并记录相应的面积值，以维生素c浓度值为横坐标，面积值为纵坐标，绘制标准曲线。

(3)色谱条件

色谱柱：Kromasil 100A C18，250mm×4．6mm，5μm。

流动相：0．1％草酸。

流速：1．0ml／min。

检测波长：254m。进样量：10μl。

5．结果计算

X=(c×V×F×100)/(m×1000000)

式中X——样品中维生素c含量[g／100g(ml)]；

c——从标准曲线查得样液维生素C的质量(μg)；

V——样品定容体积(ml)；

F——试样稀释倍数；

m——样品质量(g或ml)；

1000000——μg换算成g的换算系数。

6．注释

(1)本方法线性范围为16．3—163．0μg／ml，r=0．9998。

(2)本方法平均回收率为98．4％(17,=6)，RSD=2．56％。

(3)精密度：RSD=0．19％(n=6)。

(4)重现性：RSD=1．53％(／7,=5)。

(5)稳定性：室温8小时内基本稳定，RSD=1．24％。

(6)鉴于保健食品组方的复杂性，最好能同时对辅料做阴性确证试验。

(7)附：某维生素C咀嚼片维生素c的标准及样品色谱图(图3—141、3—142)。

维生素C色谱图

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