植物甾醇的高效液相色谱测定法

2013-10-08 分类：检测方法 0人评论

本方法适用于保健食品中植物甾醇的测定。

本方法谷甾醇和豆甾醇的检出限为0．02μg。

本方法线性范围为0．1～0．5mg／ml。

1．方法提要

试样中的谷甾醇和豆甾醇经提取后在高效反相色谱C18柱分离，用紫外检测器检测，以外标法定量谷甾醇和豆甾醇的含量。

2．仪器

高效液相色谱仪，带紫外检测器。

3．试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定的一级水。
(1)异丙醇：色谱纯。
(2)乙腈：色谱纯。
(3)乙醇。
(4)β一谷甾醇对照品：Fluka公司(纯度≥90％)。
(5)豆甾醇对照品：Fluka公司(纯度≥90％)。
(6)谷甾醇和豆甾醇混合标准溶液：精密称取13一谷甾醇和豆甾醇对照品0．0100g，移人10ml容量瓶中，加入乙醇，超声波振荡助溶，并用乙醇定容到10ml，此为浓度1．0mg/ml的标准储备液。

4．测定步骤

(1) 样品处理：称取均匀样品0．259(精确到0．1mg)，置于50ml容量瓶中，加入40ml乙醇，超声波振荡60min取出，冷却后用乙醇定容至刻度，摇匀后经0．45斗m微孔滤膜过滤，清液待分析。

(2) 标准工作曲线绘制：精密吸取β一谷甾醇和豆甾醇标准溶液(1．0mg/m1)1．0、2．0．5．0ml，分别置于10ml容量瓶中，用乙醇定容，摇匀。分别取10斗l标准工作系列溶液进样分析，以测得的B一谷甾醇和豆甾醇的峰面积，分别对β一谷甾醇和豆甾醇的浓度绘制标准曲线。

(3) 色谱条件

色谱柱：ODS C18液相色谱柱，4．6mm×250mm，5μm。
流动相：乙腈+异丙醇(70+30，V／V)。
流速：1ml／min。
柱温：室温。
紫外检测波长：210nm。

(4) 样品测定：取样品滤液10斗l进液相色谱仪分离测定，根据色谱峰保留时间定性，以外标峰面积法进行定量。

(5) 色谱图：豆甾醇和β一谷甾醇标准色谱图见图3—57，样品色谱图见3—58。

豆甾醇和β-豆甾醇色谱图

5．结果计算

根据待测样品色谱峰面积，由标准曲线回归方程式得样液中β一谷甾醇和豆甾醇含量，计算出样品中的含量。
样品中B一谷甾醇和豆甾醇含量按下式进行计算：

X=（c×V×100）/(m×100)

式中x——样品中β一谷甾醇和豆甾醇含量(g／lOOg)；
c——进样液中β一谷甾醇和豆甾醇的浓度(mg／ml)；
V——样品的定容体积(ml)；
m——样品的取样量(g)。

6．注释

植物甾醇是一类以环戊烷全氢菲为骨架(又称甾核)的物质，在自然界中主要存在于植物种子之中。植物甾醇主要成分为B一谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇等。β一谷甾醇(beta—Sitos-tero1)化学名称为5一豆甾烯一(3β)一醇，分子式为C29H50O，分子量为415，它是一种白色结晶或结晶性粉末，溶于氯仿、热乙醇、乙醚，几乎不溶于水。豆甾醇(stigmastero1)化学名称为5，22一豆甾二烯一(3β)一醇，分子式为C29H48O，分子量为413，它是一种无色结晶或结晶性粉末，溶于热乙醇、乙醚、丙酮、苯、氯仿等有机溶剂，不溶于水。β一谷甾醇、豆甾醇的结构式如图3—59、3—60。