核苷及其碱基的高效液相色谱测定法

本方法适用于以冬虫夏草和灵芝为主的保健食品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的测定。

本方法的检出限为尿嘧啶6ng，尿苷lOng，腺嘌呤16．7ng，腺苷16．7ng。

1．方法

提要冬虫夏草和灵芝中的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷用50％的乙醇超声波抽提后，于高效液相色谱中反相分离，紫外检测，以标准品的保留时间定性，以峰面积外标法定量。

2．仪器

(1) BIO—RAD高效液相色谱仪，1706多波长紫外检测器。

(2)超纯水装置：Milli—Q型。

(3)超声波提取器。

(4)溶剂微孑L过滤器(滤膜0．45μm)。

3．试剂

(1)甲醇：色谱纯。

(2)乙醇：分析纯。

(3)磷酸二氢钾：分析纯。

(4)水：三蒸水并经Milli—Q超纯处理。

(5)标准品尿嘧啶：中国科学院上海生物化学研究所。尿苷：中国科学院上海生物化学研究所。腺嘌呤：BDH公司。腺苷：中国科学院上海生物化学研究所。

(6)标准储备液：准确称取尿嘧啶30mg及尿苷、腺嘌呤、腺苷各50mg，分别置于50ml容量中，加纯水并超声波助溶，加水至刻度，混匀。

(7)单标使用液：将储备液用水稀释100倍(定性用)。

(8)混标使用液：分别准确吸取以下标准储备液(ml)(见表3—6)，置于6个10ml容量瓶中，加纯水至刻度。

混标使用液配制表

4．测定步骤

(1)样品处理

1) 胶囊、片剂、颗粒冲剂等固体粉末样品：准确称取0．5g左右粉末样品，置于25ml容量瓶中，加50％乙醇，于超声波提取器中超声波提取30min，取出，加50％乙醇至刻度，摇匀，用0．45μm微孔滤膜过滤，滤液备用。

2) 口服液或虫草鸡精等液体样品：准确吸取5ml液体样品，置于25ml容量瓶中，用50％乙醇稀释，超声波提取10min取出，加50％乙醇定容至刻度，摇匀，用0．45μm微孑L滤膜过滤，滤液备用。

(2) 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2，200mm×4．6mm，5μm。

流动相：0．01mol／L磷酸二氢钾+甲醇(92+8，V／V)。

流速：1ml／min。

检测波长：260nm。

灵敏度：0．001。

进样量：10μl。

(3 )标准曲线的绘制：分别注入各种浓度的混标使用液10出于高效液相色谱仪中，以浓度及峰面积绘制标准曲线。线性浓度范围：尿嘧啶为1．8～18μg／ml，尿苷、腺嘌呤、腺苷为0．5～5．0μg／ml。

(4)样品测定：取供色谱测定的样品溶液10μl注入高效液相色谱仪中，以标准品的保留时间定性，以峰面积外标法定量。标准品色谱图见图3—114，样品色谱图见图3—115。

标准品及样品色谱图

5．结果计算

X=(c×V)/(m×1000)

式中x——样品中核苷或碱基的含量[mg／g(ml)]；
V——样品提取后定容的体积(ml)；
c——从标准曲线查得样液中核苷或碱基的质量(μg)；
m——样品的质量(g或ml)。

6．准确度与精密度

本法线性范围：尿嘧啶为1．8～18μg／ml，尿苷、腺嘌呤、腺苷为0．5～5．0μg／ml。在同一样品中用尿苷及腺苷两种浓度测加标回收率，尿苷为93．1％～96．8％，腺苷为93．8％～96．0％，相对标准偏差分别为4．0％和3．8％(n=6)。

7．注释

(1)冬虫夏草和灵芝是我国名贵的中草药，内含活性成分很多，其中常见的核苷类化合物就有十多种，但比较有代表性的是尿苷、腺苷及其碱基。本节介绍用HPLC法对保健品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷的分离测定。

(2)样品中核苷及其碱基的提取有用热提水浴回流法，但此法提取较繁琐，且杂质较多，经试验用高频超声波提取30min为佳，样品(液)如脂肪含量太高，可用乙醚(15ml×2)脱脂，乙醚用少量水洗，弃醚层，水层定容(或将水层蒸干，残渣用50％乙醇溶解定容至一定体积)后为样液。

(3)流动相的pH对核苷或其碱基的分离影响比较大，如尿嘧啶峰前杂质比较多，可调节流动相醇水比例以排除干扰。

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