叶黄素的高效液相色谱测定法(一)

本方法适用于保健食品营养补充剂中叶黄素(lutein)的测定。

本方法叶黄素的检出限为2．7ng／ml。

1．方法提要

样品中的叶黄素用无水乙醇抽提后，在高效液相色谱仪中446nm处检测，以外标法定量。

2．仪器

高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波提取器、旋涡混合器、离心机(10000r／min)、紫外分光光度计。

3．试剂

叶黄素标准品：Fluka公司，90％(HPLC)；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；二氯甲烷(AR)；无水乙醇(HPLC级)；超纯水。

4．测定步骤

(1) 样品处理：将20粒以上的胶囊内容物，充分混合均匀，准确称取适量样品约1．000g，置于lOOml棕色容量瓶中，加5ml 60℃的水，于60℃水浴中超声波提取5min，冷却后，加无水乙醇至100ml刻度，在旋涡混合器中充分振荡均匀，静置，吸取上清液置于小塑料离心管中，10000r／min离心3min，取出一定量(0．20～0．5ml)上清液置于10ml具塞试管中，用高纯氮气小心吹干，加1．0ml甲醇溶解，在HPLC中进样测定。

(2) 标准溶液的标定和配制：取叶黄素标准品约1mg，用无水乙醇溶解并定容在5ml棕色容量瓶中，用下法标定其准确浓度：准确吸取0．06ml标准溶液，加于5．0ml无水乙醇中，用紫外分光光度计以无水乙醇调零点，用10m比色皿于446nm处测定吸光度值(吸光度值约在0．4左右)，并计算叶黄素标准液的浓度。平行测定三份，取均值。

叶黄素(μg／ml)=（A×5.06）/(0.2560×0.06)

式中A——标准溶液在446nm处的吸光度值；

0．2560——叶黄素在无水乙醇溶液中，入射光波长446nm，比色皿厚度为1cm，溶液浓度为1mg／L的吸光系数；

5.06/0.06——测定过程中稀释倍数的换算系数。

(3 )色谱条件

色谱柱：Kromasil 100 AC18，250mm×4．6mm，5μm。

流动相：乙腈+二氯甲烷+甲醇(85+10+5，V／V／V)。

检测波长：446nm。

流速：0．8ml／min。

进样量：10μl。

(4) 测定：分别吸取2．0μg／ml、6．0μg／ml、10．0μg／ml、14．0μg／ml、18．0μg／ml的标准使用液及样品液各10μl，注入高效液相色谱仪中进行分离，以标准溶液出峰的保留时间定性，记录相应的峰面积，绘制标准曲线图，以外标法定量。

5．结果计算

X=(c×V1×100)/(m×V2×1000)

叶黄素标准曲线图

式中X——样品中叶黄素的含量(mg／100g)；

c——从标准曲线查得样液中叶黄素的浓度(μg／ml)；

m——样品质量(g)；

E——样品定容体积(ml)；

K——样品测定液体积(ml)；

1000——μg转换成mg的换算系数。

6．注释

(1) 本方法线性范围为2．0～18．0μg／ml。Y=308389x+23829，r=0．9989。

(2) 本方法平均回收率为97．8％。

(3) 精密度RSD为3．2％(n=6)。

(4)如样品添加的为微胶囊化叶黄素，提取时要先加5ml60％的水，并在60℃的水浴中超声波提取5min，使微胶囊外壳的有机膜溶解，令叶黄素析出，再用有机溶剂提取。实验证明，如用有机溶剂直接提此类样品的叶黄素，只相当于前者的85％。对非微胶囊化的叶黄素则应用有机溶剂直接提取。

(5)本样品为添加叶黄素的营养素补充剂，并非天然的结合型的类胡萝b素，样品中脂质较少，曾用三种有机溶剂提取，提取率高低为无水乙醇>丙酮>石油醚+丙酮(1+1)，所以选用无水乙醇为提取溶剂。

(6)叶黄素同属类胡萝b素，见光、遇氧容易破坏，样品的提取及分析过程应在弱光中操作，如处理大量样品可加0．1g的二丁基羟甲基苯，标准溶液应及时标定。

(7)附：某胶囊样品叶黄素标准及样品色谱图(图3—152、3—153)。

叶黄素色谱图

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