叶黄素的高效液相色谱测定法（二）

本方法适用于含叶黄素酯的保健食品中叶黄素含量的测定。

本方法叶黄素的检出限为3ng。

本方法线性范围为1．0～10μg／ml。

1．方法提要

试样经皂化一萃取法提取叶黄素，在高效反相色谱C18柱上分离，用紫外检测器检测，以外标法定量。

2．仪器

高效液相色谱仪，带紫外检测器。

3．试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定的一级水。

(1)50％(M／M)氢氧化钾溶液：称取509氢氧化钠(分析纯)，加509去离子水溶解。

(2)甲醇：色谱纯。

(3)乙腈：色谱纯。

(4)无水乙醇。

(5)抗坏血酸。

(6)乙醚+石油醚溶液：乙醚+石油醚=1+1(V+V)。

(7)叶黄素对照品：Fluka公司，纯度90％。

(8)叶黄素标准溶液(10μg／ml)：精密称取叶黄素标准品约0．0010g，移人100ml容量瓶中，加入20ml无水乙醇，60％超声波溶解5min，冷却后并用无水乙醇定容到100ml，成浓度约为10μg／ml的标准溶液。标准溶液应进行测定校准。用1cm比色皿，以无水乙醇作为空白，在445nm处测定标准溶液的吸收度Amax。标准溶液的浓度为：

X(μg／ml)= （Amax ×10000）/2550

4．测定步骤

(1) 样品处理

1) 皂化：准确称取约250mg样品(精确至0．1mg)，置于150ml圆底烧瓶中，加入5ml水，0．5g抗坏血酸，摇匀，加入30ml无水乙醇，摇匀到颗粒分散，再加入10ml氢氧化钾溶液摇匀，于75℃水浴皂化30min，取出后冷却。

2) 提取：将皂化好的样品移入250ml分液漏斗中，用少量水洗涤皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用50ml乙醚+石油醚溶液洗涤皂化瓶及残渣，并人分液漏斗中，振摇2min，静置分层，水层再用50ml乙醚+石油醚溶液萃取，合并醚层。

3) 洗涤：每次用水约50ml洗涤醚层，用pH试纸检验直到水层中性。

4) 浓缩：将醚层倒入100ml圆底烧瓶中，于55℃减压蒸馏到2rnl，用氮气吹干，加入10ml无水乙醇，充分混合，根据分析需要，再取此溶液用无水乙醇稀释，得分析液。分析液过0．45μm微孑L滤膜，待用。

(2) 标准工作曲线制作：取叶黄素标准溶液(10μg／ml)配制成1．0μg／ml、5．0μg／ml、10μg／ml标准工作系列溶液进样分析，以测得的叶黄素的峰面积分别对叶黄素的浓度绘制标准曲线。

(3) 色谱条件

色谱柱：Pursuit C18液相色谱柱，250mm×4．6mm，5μm。

流动相：甲醇+乙腈+色谱用水(10+9+1，V／V／V)。

流速：1ml／min。

柱温：35℃。

检测波长：446nm。

(4) 样品测定：取样品滤液10μl进液相色谱仪分离测定，根据色谱峰保留时间定性，以外标峰面积法进行定量。

(5)色谱图：叶黄素标准色谱图见图3—154

图3—154 叶黄素标准色谱图

5．结果计算

根据待测样品色谱峰面积，由标准回归方程式得样液中叶黄素含量，计算出样品中的含量。样品中叶黄素含量按下式进行计算：

X=(c×V×100)/(m×1000×1000)

式中X——样品中叶黄素含量(g／100g)；

c——进样液中叶黄素的浓度(μg／ml)；

V——样品的定容体积(ml)；

m——样品的取样量(g)。

6．注释

(1 )叶黄素的化学名称为3，3’一二羟基一d一胡萝卜素，分子式为C49H56O2。它不溶于水，易溶于油脂和脂肪性溶剂。纯的叶黄素为棱格状黄色晶体，有金属光泽，对光和氧不稳定，需贮存于阴凉干燥处，避光密封。

(2)样品前处理需避光。

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