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甘草酸的高效液相色谱测定法

最后修改:2013-09-20 10:13    分类:医药中间体    0人评论

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本方法适用于保健食品中甘草酸的测定。

本方法的检出限为50.0μg。

1.方法提要

样品中的甘草酸用20%乙醇溶液提取,C18柱分离,高效液相色谱254nm波长测定,与对照品的保留时间比较定性,用峰面积外标法定量。

2.仪器

(1)Waters一2690高效液相色谱仪,996二极管阵列检测器。

(2)超声波提取器。

3.试剂

所用试剂除特殊注明外均为分析纯;实验用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

(1)20%乙醇溶液:取无水乙醇20ml,加水80ml,混匀。

(2)冰醋酸。

(3)乙腈。

(4)甘草酸标准溶液:准确称取甘草酸对照品50.0mg,用20%乙醇溶液溶解并定容至50ml,混匀。此溶液每1ml含甘草酸1.0mg。

4.测定步骤

(1)样品处理

1) 固体样品:准确称取固体样品2.0g左右,用20%乙醇溶液40ml超声提取20min,再用20%乙醇溶液定容至50ml,过滤,滤液再经0.45μm滤膜过滤,备用。

2) 液体样品:准确吸取液体样品5ml,加20%乙醇溶液至40ml左右,超声波提取20min,用20%乙醇溶液定容至50ml,过滤,滤液再经0.45μm滤膜过滤,备用。

(2)色谱条件

色谱柱:C18柱,200mm×4.6mm。

流动相:水+乙腈+冰醋酸(63+37+0.15)。

流速:1.0ml/min。

检测波长:254nm。

进样量:10μl。

(3) 标准曲线的绘制:准确吸取甘草酸标准溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml,置于10ml容量瓶中,用20%乙醇溶液稀释至刻度,混匀后分别取10¨l标准溶液注入高效液相色谱仪,在下述条件进行测定,并绘制标准曲线。标准曲线浓度为0.05mg/ml、0.10mg/ml、0.20mg/ml、0.40mg/ml、0.60mg/ml、0.80mg/ml、1.0mg/ml。回归方程Y=1015.43x一203.92。r=0.9997。

(4) 样品测定:准确吸取样品处理液10μl,注入高效液相色谱仪分离测定,以对照品峰的保留时间定性,以峰面积外标法定量。甘草酸对照品色谱图见图3—25,样品(甘草酸精)色谱图见图3—26,甘草酸的标准曲线图见图3—27。

甘草酸对照品色谱图

甘草酸对照品色谱图

甘草酸样品色谱图

甘草酸样品色谱图

甘草酸的标准曲线图

甘草酸的标准曲线图

5.结果计算

X=(c×V)/m

式中X——样品中甘草酸含量[μg/g(ml)];

c——外标法得出的测定样品中甘草酸浓度(μg/ml);

m——分析样品的质量(g或ml);

6.准确度和精密度

不同样品不同浓度的加标回收率为85.3%~94.4%。重复10次,测定结果的RSD为8.6%。

7.注释

(1)甘草酸(glucyrrhizic acid)是甘草中含有的三萜类物质。甘草酸的钾、钙盐为甘草的主要甜味成分,亦称甘草甜素或甘草苷,属酸性皂苷。

(2)甘草酸具有肾上腺激素作用,亦具有消炎、抑制病毒、促进脂质代谢等作用。

(3)甘草酸易溶于热水、稀乙醇,不溶于无水乙醇或乙醚等。甘草酸在甘草中以钾盐或钙盐形式存在,其水溶液酸化后可析出皂苷,溶于丁醇或乙酸乙酯。

(4)当样品组分复杂、干扰因素多时,可采用以下方法提取样品:固体样品用1%氨水溶液浸泡萃取甘草酸,萃取液用3mol/L盐酸调至pH2.0后,以丁醇+乙酸乙酯(3+7)萃取,除去水溶性杂质,再用1%氨水从丁醇+乙酸乙酯溶液中反萃取甘草酸;提取液用醋酸调至pH中性后加无水乙醇使溶液为20%乙醇溶液供测定。液体样品则直接用3mol/L盐酸调至pH2.0后,用丁醇+乙酸乙酯(3+7)溶液提取后按上述方法进行。

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