儿茶素的高效液相色谱测定法

2013-10-07 分类：检测方法 0人评论

本方法适用于茶类保健食品中儿茶素含量的测定。

本方法检出限：表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)均为0．02μg。

本方法线性范围：表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)均为20～500μg／ml。

1．方法提要

试样中的儿茶素经提取后在苯基己基色谱柱上分离，根据保留时间定性，用紫外检测器测定儿茶素的含量。

2．仪器

高效液相色谱仪带紫外检测器。

3．试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定的一级水。
(1)乙腈：色谱纯。
(2)甲醇：色谱纯。
(3)提取液：水+甲醇(30+70，V／V)。
(4)乙酸。
(5)乙二胺四乙酸钠溶液(10mg／ml)：称取1．09乙二胺四乙酸钠(精确到1mg)，置于100ml容量瓶中，加入50ml热水，超声溶解，冷却后用水定容到刻度，混匀。溶液需临用现配。
(6)抗坏血酸溶液(10mg／m1)：称取1．0g抗坏血酸(精确到1mg)，置于100ml容量瓶中，加入水，超声溶解，冷却后用水定容到刻度，混匀。溶液需临用现配。
(7)稳定溶液[含乙二胺四乙酸钠(500wg／m1)和抗坏血酸(5001．zg／m1)的10％(V／V)的乙腈水溶液]：吸取25ml乙二胺四乙酸钠(10mg／m1)和25ml抗坏血酸(10mg／m1)，置于500ml容量瓶中，加入50ml乙腈，用水定容到刻度，混匀。溶液需临用现配。
(8)流动相
1)流动相A[2％(V／V)的乙酸水溶液(含20μg／ml乙二胺四乙酸钠)]：吸取20ml乙酸和2ml乙二胺四乙酸钠(10mg／m1)溶液，置于1000ml容量瓶中，用水定容到刻度，混匀。溶液经微孑L滤膜过滤，待用。
2)流动相B[2％(V／V)的乙酸的乙腈溶液(含20ixg／ml乙二胺四乙酸钠)]：吸取20ml乙酸和2ml乙二胺四乙酸钠(10mg／m1)溶液于1000ml容量瓶中，用乙腈定容到刻度，混匀。溶液经微孑L滤膜过滤，待用。
(9)七种儿茶素对照品：表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)，Sigma公司产品(纯度≥98％)。
(10)儿茶素混合储备溶液(1．0mg／m1)：精确称取七种儿茶素对照品各10mg，用水定容至10．00ml，即得儿茶素混合储备溶液(1．0mg／m1)。

4．测定步骤

(1)样品处理
1)速溶茶类：称取0．5g(精确到0．1mg)样品，置于50ral容量瓶中，加入25ml60℃热水，超声振荡5min，取出，冷却后加5ml乙腈，用水定容到50ml，摇匀。
2)叶茶类：称取0．2g(精确到0．1mg)样品，置于lOml有刻度的玻璃离心管中，加入5ml 70℃左右的提取液，摇匀，70℃水浴10min，每5min振摇一次。取出离心管，冷却后3500r／min离心10min。取上清液加入lOml容量瓶中，用常温的提取液定容到刻度，摇匀。
3)取2ml速溶茶类或叶茶类的提取液，置于50ml容量瓶中，用稳定溶液定容到刻度，摇匀后经0．45斗m滤膜过滤，清液待分析。
(2)标准曲线制作：精密吸取儿茶素混合储备溶液，用稳定溶液逐级稀释并配制标准工作系列溶液，其浓度分别为20．0μg／ml、50．0μg／ml、500μg／ml，取lOμl进样分析，以测得的每种儿茶素的峰面积分别对其浓度绘制标准曲线。
(3)色谱条件
色谱柱：Phenomenex Luna，Phenyl—Hexyl色谱柱，250mm×4．6mm，5Ixm。
流动相(A+B)梯度洗脱体系：0～5min：92％A；5～20min：92％A～82％A；20～25min：82％A～50％A；25～30min：50％A；30～38min：50％A～92％A。
流速：1．0ml／min。
柱温：室温。紫外检测器波长：278nm。
(4)样品测定：取样品滤液10斗l进液相色谱仪分离测定，根据色谱峰保留时间定性，用外标峰面积法进行定量。
(5)色谱图图3—36七种儿茶素和咖啡因的标准色谱图

儿茶素标品色谱图

5．结果计算

根据待测样品色谱峰面积，由标准回归方程式中得样品液中每种儿茶素含量，计算出样品中的每种儿茶素含量。样品中每种儿茶素含量按下式进行计算。

X=(c×V×100)/(m×1000×1000)

儿茶素样品色谱图

式中x——样品中每种儿茶素含量[g／100g(ml)]；
c——样品液中儿茶素的浓度(μg／ml)；
V——样品的定容体积(ml)；
m——样品的取样量(g)。
七种茶素含量的总和即为样品的儿茶素含量。

6．注释

(1)儿茶素类属于多元酚类中的一种，是以儿茶素为主体结构与没食子酸基团结合形成的一类活性物质。它主要由表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)等几种成分组成。它可溶于热水、乙醇、冰醋酸和丙酮，不溶于苯、氯仿和石油醚。儿茶素类是茶叶的重要成分。
(2)标准工作系列溶液在一20℃的情况下可保存两个月。样品提取液在4℃的情况下可保存24小时。
(3)本方法可同时测定咖啡因。

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