本方法适用于保健食品中虫草酸(甘露醇)含量的测定。
本方法虫草酸检出限为0.1μg。本方法线性范围为0.1~1.0mg/ml。
1.方法
提要试样中的虫草酸经提取后在氨基色谱柱上分离,根据保留时间定性,用蒸发光散射检测器测定虫草酸的含量。
2.仪器
高效液相色谱仪,带SEDEX 75蒸发光散射检测器。
3.试剂
除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
(1)乙腈:色谱纯。
(2)无水乙醇。
(3)提取液:水+乙醇(40+60,V/V)。
(4)虫草酸对照品:Supelco公司(纯度≥99%)。
(5)虫草酸标准溶液(10.0mg/ml):精确称取250mg虫草酸,置于25ml容量瓶中,用蒸馏水定容,即得虫草酸标准溶液。
4.测定步骤
(1)样品处理
1)固体样品:取均匀样品0.50g(精确到0.1mg),置于25ml容量瓶中,加入20ml提取液,混匀,超声波振荡30min,取出,冷却后用提取液定容,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,清液待分析。
2)液体样品:取均匀样品10ml,置于25ml容量瓶中,加入无水乙醇定容到25ml,混匀,超声波振荡30min,取出,冷却后摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,清液待分析。
(2)标准工作曲线绘制:精密吸取虫草酸标准溶液1.0ml、5.0ml、10.0ml,分别置于100ml
容量瓶中,用蒸馏水定容,摇匀。分别取10μ1标准工作系列溶液进样分析,以测得的虫革酸的峰面积分别对虫草酸的浓度绘制标准曲线。
(3)色谱条件
色谱柱:氨基液相色谱柱,250mm×4.6mm,5μm。
流动相:流动相A为水,流动相B为乙腈。
梯度洗脱体系:0~23min:22%A~30%A;23~27min:30%A;27~28min:30%A~22%A;28~33min:22%A。
流速:1.0ml/min。
柱温:室温。
蒸发光散射检测:蒸发温度35℃,压力3.5Bar。
(4) 样品测定:取样品滤液101山1进液相色谱仪分离测定,根据色谱峰保留时间定性,以外标峰面积法进行定量。
(5)色谱图:虫草酸标准色谱图见图3—92,样品色谱图见图3—93。
5.结果计算
根据待测样品色谱峰面积,由标准曲线回归方程式得样品液中虫草酸含量,计算出样品中的含量。样品中虫草酸含量按下式进行计算:
X=(c×V×100)/(m×1000)
式中X——样品中虫草酸含量[g/1009(ml)];
c——进样液中虫草酸的浓度(mg/ml);
V——样品的定容体积(ml);
m——样品的取样量(g)。
6.注释
(1)虫草酸又名甘露醇,分子式为C6H14O6,分子量为182,它为白色针状结晶。1g该品可溶于约5.5ml水(约18%,25℃)、83ml乙醇,较多地溶于热水,溶于吡啶和苯胺,不溶于醚。虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要指标之一,一般认为虫草酸含量高的虫草药用价值大。
(2)检测器也可用示差检测器,检测池温度35℃,但检测灵敏度低于蒸发光散射检测器。
(3)流动相也可用水+乙腈(22+78,V/V)梯度洗脱,本方法中用梯度洗脱是为了防止某些强滞留杂质干扰检测。
(4)蒸发光散射检测器的响应值(Y)与被测物浓度(x)的关系曲线结构式由于仪器品牌和结构的不同,大多可能是指数关系,即Y=αx6,但少数也可能是二次函数关系,即Y=αx+bx2,可以根据实际情况选择合适的关系曲线。
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