虫草酸(甘露醇)的高效液相色谱测定法

本方法适用于保健食品中虫草酸(甘露醇)含量的测定。

本方法虫草酸检出限为0．1μg。本方法线性范围为0．1~1．0mg／ml。

1．方法

提要试样中的虫草酸经提取后在氨基色谱柱上分离，根据保留时间定性，用蒸发光散射检测器测定虫草酸的含量。

2．仪器

高效液相色谱仪，带SEDEX 75蒸发光散射检测器。

3．试剂

除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定的一级水。

(1)乙腈：色谱纯。

(2)无水乙醇。

(3)提取液：水+乙醇(40+60，V／V)。

(4)虫草酸对照品：Supelco公司(纯度≥99％)。

(5)虫草酸标准溶液(10．0mg／ml)：精确称取250mg虫草酸，置于25ml容量瓶中，用蒸馏水定容，即得虫草酸标准溶液。

4．测定步骤

(1)样品处理

1)固体样品：取均匀样品0．50g(精确到0．1mg)，置于25ml容量瓶中，加入20ml提取液，混匀，超声波振荡30min，取出，冷却后用提取液定容，摇匀，经0．45μm微孔滤膜过滤，清液待分析。

2)液体样品：取均匀样品10ml，置于25ml容量瓶中，加入无水乙醇定容到25ml，混匀，超声波振荡30min，取出，冷却后摇匀，经0．45μm微孔滤膜过滤，清液待分析。

(2)标准工作曲线绘制：精密吸取虫草酸标准溶液1．0ml、5．0ml、10．0ml，分别置于100ml

容量瓶中，用蒸馏水定容，摇匀。分别取10μ1标准工作系列溶液进样分析，以测得的虫革酸的峰面积分别对虫草酸的浓度绘制标准曲线。

(3)色谱条件

色谱柱：氨基液相色谱柱，250mm×4．6mm，5μm。

流动相：流动相A为水，流动相B为乙腈。

梯度洗脱体系：0～23min：22％A～30％A；23～27min：30％A；27～28min：30％A～22％A；28～33min：22％A。

流速：1．0ml／min。

柱温：室温。

蒸发光散射检测：蒸发温度35℃，压力3．5Bar。

(4) 样品测定：取样品滤液101山1进液相色谱仪分离测定，根据色谱峰保留时间定性，以外标峰面积法进行定量。

(5)色谱图：虫草酸标准色谱图见图3—92，样品色谱图见图3—93。

虫草素标品和样品色谱图

5．结果计算

根据待测样品色谱峰面积，由标准曲线回归方程式得样品液中虫草酸含量，计算出样品中的含量。样品中虫草酸含量按下式进行计算：

X=(c×V×100)/(m×1000)

式中X——样品中虫草酸含量[g／1009(ml)]；

c——进样液中虫草酸的浓度(mg／ml)；

V——样品的定容体积(ml)；

m——样品的取样量(g)。

6．注释

(1)虫草酸又名甘露醇，分子式为C6H14O6，分子量为182，它为白色针状结晶。1g该品可溶于约5．5ml水(约18％，25℃)、83ml乙醇，较多地溶于热水，溶于吡啶和苯胺，不溶于醚。虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要指标之一，一般认为虫草酸含量高的虫草药用价值大。

(2)检测器也可用示差检测器，检测池温度35℃，但检测灵敏度低于蒸发光散射检测器。

(3)流动相也可用水+乙腈(22+78，V／V)梯度洗脱，本方法中用梯度洗脱是为了防止某些强滞留杂质干扰检测。

(4)蒸发光散射检测器的响应值(Y)与被测物浓度(x)的关系曲线结构式由于仪器品牌和结构的不同，大多可能是指数关系，即Y=αx⁶，但少数也可能是二次函数关系，即Y=αx+bx²，可以根据实际情况选择合适的关系曲线。

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