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总三萜的分光光度测定法

2013-10-30    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于灵芝制品(灵芝孢子粉、灵芝孢子油)中总三萜(triterpenes)含量测定。

1.方法

提要灵芝孢子中含有一百二十多种三萜类化合物,其结构十分复杂,要分离获得高纯度具有代表性的三萜化合物对照品技术难度大,因此,对于总三萜化合物含量的常规测定方法,目前仍以在自然界广泛存在的三萜化合物熊果酸为对照品,以分光光度法测定。

由于熊果酸与三萜类化合物的分子结构中均有相似的官能团结构,在特定的显色剂作用下,在548nm处显示相同的吸收特征,本法测得的含量实际为总三萜化合物含量,而非单一熊果酸含量,对该含量的测定结果以总三萜化合物表示。

2.主要仪器

(1)分光光度计。

(2)离心机(3000r/min)。

(3)旋涡混合器。

(4)超声波提取器。

(5)水浴锅。

3.试剂

实验用水为双蒸水,所有试剂为分析纯级别。

(1)三氯甲烷。

(2)冰醋酸。

(3)高氯酸。

(4)乙酸乙酯。

(5)香草醛:5%香草醛冰醋酸溶液(m/V)。

(6)熊果酸:Sigma公司,含量97%。准确称取熊果酸标准品11.7mg,置于100ml容量瓶中,用乙酸乙酯溶解,并定容至100ml,配成0.117mg/ml的标准贮备液。

4.测定步骤

(1) 灵芝孢子粉类样品:准确称取均匀的样品0.3~0.5g,置于50ml容量瓶中,加约30ml氯仿,置超声波提取器中强力超声波提取30min,取出冷却至室温,并加氯仿至刻度,摇匀,取上清液0.3~0.5ml(若提取液混浊可过滤)置于10ml比色管中,于60℃水浴中蒸干(或加氮气吹干),然后加入0.4ml 5%香草醛冰醋酸溶液,混匀,加1.0ml高氯酸,混匀,在60℃水浴中加热15min后移入冰浴中冷却,并加入冰醋酸5ml,混匀后置室温下,在15~30min内,在分光光度计548nm处测定并记录吸光度值。

(2) 灵芝孢子油类样品:准确称取灵芝孢子油类样品100mg左右,置于50ml容量瓶中,加乙酸乙酯溶解并定容到刻度,混匀后吸取0.1~0.3ml置于lOml比色管中,同上法测定。

(3) 标准曲线的绘制:分别吸取熊果酸标准溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml(相当于熊果酸0~58.5μg),置于10ml比色管中,于60℃水浴中蒸干(或加氮气吹干),同上法测定,并分别记录各吸光度值,以熊果酸质量为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制标准曲线图。

熊果酸标准曲线

熊果酸标准曲线

5.结果计算

总三萜化合物(以熊果酸计,mg/100g)=(A1×V1×100)/(m×V2×1000)

式中A1——样品测定液中比色相当于熊果酸的量(μg);

V1——样品测定液体积(ml);

m——样品质量(g);

V2——测定用样品测定液体积(ml);

1000——μg换算成mg的换算系数。

6.注释

(1) 香草醛一冰醋酸、高氯酸比色法是测定三萜类化合物常用的方法,但其影响因素较多,尤其是对选择何种标准品(灵芝酸B、熊果酸、齐墩果酸)、试剂的用量、反应时温度以及反应后放置时间等因素影响较为显著,故在实验中应严格控制反应条件,才能得到较为稳定及重现性好的结果。

(2) 由于保健食品配方组成的复杂性,提取溶剂可在氯仿、无水乙醇中选择,最好能做预实验,因不同组方的保健品用无水乙醇提取结果会比氯仿高。

(3) 本方法线性范围为11.7~58.5μg/ml,y=12.991x一0.0274,r=0.9993。

(4)本方法平均回收率为96.5%。

(5)精密度RSD=3.5%(17,=8)。

(6)方法学认证:经选择不同的测定波长(540—552nm)、不同的显色剂用量(0.1~0.6ml)、不同的高氯酸用量(0.6~1.4ml)、不同的水浴反应温度(40℃~80℃)和不同的时间段显色稳定性(5~100min)实验,以上述操作的反应条件为最佳。

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