大豆异黄酮的高效液相色谱测定法

2013-10-04 分类：检测方法 0人评论

本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。
本方法大豆异黄酮染料木素的检出限为10ng，大豆苷元的检出限为30ng。

1．方法

提要大豆异黄酮(soybean isoflavones，简称ISO)是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型糖苷两类共有12种，染料木素(genistein，G)和大豆苷元(daidzeiu，D)是其中两种重要化合物。本法用80％乙醇作为溶剂，提取样品中的染料木素、大豆苷元，以反相高效液相色谱分离，在紫外检测器260nm条件下检测其峰而积，以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。

2．仪器

(1)LC高效液相色谱仪，C—RIB色谱处理机。
(2)检测器：SPD一2AS紫外检测器。
(3)离心机。(4)超声波振荡器。

3．试剂

(1)甲醇：色谱纯。
(2)乙醇：优级纯。
(3)双重蒸馏水。
(4)大豆异黄酮标准品：染料木素与大豆苷元标准品，美国Sigma公司产品。以染料木素和大豆苷元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。
(5)大豆异黄酮标准溶液：准确称取染料木素标准品5．0mg，大豆苷元标准品3．2mg，各自用流动相甲醇+水(60+40)定容至100ml，配制成50μg／ml的染料木素和32μg／ml的大豆苷元标准溶液。

4．测定步骤

(1) 样品处理

1) 固体样品：准确称取一定量固体粉末样品置于100ml容量瓶中，加入80％乙醇，经超声振荡5min，加水补足至刻度，待提取液略澄清后经离心分离(3000r／min，5min)，取上清液经0．45μm滤膜过滤后待进样。
2) 液体样品：准确吸取2．0ml液体样品，加入80％乙醇摇匀并定容100ml，澄清后按上述步骤操作。

(2) 色谱条件

色谱柱：Shim—Pack CLC—ODS，6mm×150mm，5μm。

流动相：甲醇+水(60+40)，临用前用超声波除气。

流速：0～5min为1．0ml／min；5～10min为1．6ml／min。

柱温：40℃。

检测波长：260nm。

灵敏度：0．016 AUFS。

进样量：10μl。

(3) 样品测定：准确称取样品处理液和标准液各10μl(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样液中待测物质的含量。

标准色谱图见图3—34，样品色谱图见图3—35。

大豆异黄酮色谱图

5．结果计算

X=(S1×c×V)/(S2×m)

式中x——样品中染料木素／大豆苷元的含量(μg／g)；
S1——样品峰面积；
c——标准溶液浓度(μg／m1)；
S2——标准溶液峰面积；
V——样品定容体积(m1)；
m——试样质量(g)。
样品中大豆异黄酮含量X(μg／g)=Xg+Xd(Xg、Xd分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量)

6．注释

(1)本法染料木素浓度在0．01～0．1mg／ml范围内呈直线关系，相关系数为0．9996；大豆苷元浓度在0．003～0．03mg／ml范围内呈直线关系，相关系数为0．9945。

(2)精密度：同一样品依本法重复6次，染料木素、大豆苷元的相对标准差(RSD)分别为3．1％及1．2％。

(3)回收率：依本法各取试样9份，每3份为一组，分别加入不同量标准品进行试样处理，染料木素添加回收率为95．0％～103．7％，大豆苷元添加回收率为95．8％～105．5％。

参考文献

Naokazu OHTA，GoYo Kuwata，Hiroshi Akahor，etal．Isoflavo Noid Constituents of Soy—beans and Isolationof A Newaeetyl Daidzin．Agric．Biol．Chem 1979；43(7)：1415～1419

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