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大豆异黄酮的高效液相色谱测定法

2013-10-04    分类:检测方法    0人评论

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本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。
本方法大豆异黄酮染料木素的检出限为10ng,大豆苷元的检出限为30ng。

1.方法

提要大豆异黄酮(soybean isoflavones,简称ISO)是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型糖苷两类共有12种,染料木素(genistein,G)和大豆苷元(daidzeiu,D)是其中两种重要化合物。本法用80%乙醇作为溶剂,提取样品中的染料木素、大豆苷元,以反相高效液相色谱分离,在紫外检测器260nm条件下检测其峰而积,以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。

2.仪器

(1)LC高效液相色谱仪,C—RIB色谱处理机。
(2)检测器:SPD一2AS紫外检测器。
(3)离心机。(4)超声波振荡器。

3.试剂

(1)甲醇:色谱纯。
(2)乙醇:优级纯。
(3)双重蒸馏水。
(4)大豆异黄酮标准品:染料木素与大豆苷元标准品,美国Sigma公司产品。以染料木素和大豆苷元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。
(5)大豆异黄酮标准溶液:准确称取染料木素标准品5.0mg,大豆苷元标准品3.2mg,各自用流动相甲醇+水(60+40)定容至100ml,配制成50μg/ml的染料木素和32μg/ml的大豆苷元标准溶液。

4.测定步骤

(1) 样品处理

1) 固体样品:准确称取一定量固体粉末样品置于100ml容量瓶中,加入80%乙醇,经超声振荡5min,加水补足至刻度,待提取液略澄清后经离心分离(3000r/min,5min),取上清液经0.45μm滤膜过滤后待进样。
2) 液体样品:准确吸取2.0ml液体样品,加入80%乙醇摇匀并定容100ml,澄清后按上述步骤操作。

(2) 色谱条件

色谱柱:Shim—Pack CLC—ODS,6mm×150mm,5μm。

流动相:甲醇+水(60+40),临用前用超声波除气。

流速:0~5min为1.0ml/min;5~10min为1.6ml/min。

柱温:40℃。

检测波长:260nm。

灵敏度:0.016 AUFS。

进样量:10μl。

(3) 样品测定:准确称取样品处理液和标准液各10μl(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间进行定性,利用峰面积求出样液中待测物质的含量。

标准色谱图见图3—34,样品色谱图见图3—35。

大豆异黄酮色谱图

大豆异黄酮色谱图

5.结果计算

X=(S1×c×V)/(S2×m)

式中x——样品中染料木素/大豆苷元的含量(μg/g);
S1——样品峰面积;
c——标准溶液浓度(μg/m1);
S2——标准溶液峰面积;
V——样品定容体积(m1);
m——试样质量(g)。
样品中大豆异黄酮含量X(μg/g)=Xg+Xd(Xg、Xd分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量)

6.注释

(1)本法染料木素浓度在0.01~0.1mg/ml范围内呈直线关系,相关系数为0.9996;大豆苷元浓度在0.003~0.03mg/ml范围内呈直线关系,相关系数为0.9945。

(2)精密度:同一样品依本法重复6次,染料木素、大豆苷元的相对标准差(RSD)分别为3.1%及1.2%。

(3)回收率:依本法各取试样9份,每3份为一组,分别加入不同量标准品进行试样处理,染料木素添加回收率为95.0%~103.7%,大豆苷元添加回收率为95.8%~105.5%。

参考文献

Naokazu OHTA,GoYo Kuwata,Hiroshi Akahor,etal.Isoflavo Noid Constituents of Soy—beans and Isolationof A Newaeetyl Daidzin.Agric.Biol.Chem 1979;43(7):1415~1419

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