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原花青素的铁盐催化比色测定法

2013-10-06    分类:检测方法    0人评论

1.方法提要

原花青素(procyanidins,简称为PC)是植物王国中广泛存在的一类黄烷一3一醇衍生物的总称,因聚合度的不同以及单体的构象或键合位置的不同可形成多种化合物。原花青素氧化后能生成红色的花青素。通常用铁盐催化比色法测定总量,利用硫酸高铁铵的催化作用,以盐酸水解将之转变为红色的花青素,花青素在550nm处有最大吸收峰,比色测定其吸光值(OD550),与原花青素化学对照品比较,便可定量计算出样品中原花青素的含量。

2.仪器

分光光度计、恒温水浴箱。

3. 试剂

(1)原花青素(化学对照品,Bassett international naturals公司生产,天津尖峰天然产物开发公司分装)、无水乙醇、正丁醇、浓盐酸、硫酸高铁铵均为分析纯,无离子水。

(2)20%硫酸高铁铵:取10gFeNH4(so4)2·12H20,用2mol/L盐酸溶解定容至50ml。

(3)反应混合液:取正丁醇、浓盐酸、20%FeNH4(so4)2 溶液按85:5:0.4(体积比)比例混合均匀,备用。

(4)标准溶液的配制:准确称取经干燥的原花青素化学对照品52mg(精确至0.00019),用无水乙醇溶解,并准确定容至100ml,制得浓度为0.52mg/ml的标准溶液。再用无水乙醇稀释配制成浓度为0μg/ml、26.00μg/ml、52.00μg/ml、104.Oμg/ml、208.Oμg/ml、312.0μg/ml、416.0μg/ml的标准系列使用液。

4.测定步骤

(1) 标准曲线的绘制:分别移取上述不同浓度系列使用液1.00ml置于lOml刻度试管中,加入9ml上述反应混合液,置于沸水浴中加热,待水浴温度恢复至(99±1)℃时开始计时,并塞紧塞子(勿摇匀),准确加热40rain后,立即取出,用冰水快速冷却至室温,以正丁醇定容至刻度线,塞紧后充分摇匀,在550nm处以空白管调零扣除背景,测定吸光值OD550,并以最小二乘法绘制原花青素浓度(μg)一吸光值OD550曲线。

(2) 待测样品液的制备:精确称取胶囊内容物0.5~1.0g,加无水乙醇(遇醇溶性较差的样品,可加入少量的蒸馏水促进溶解),溶解(对于软胶囊取整粒称重后再用小刀割破,用超声波以乙醇多次提取)、定容至100ml,摇匀,即得到样品储备液。再移取0.5~1ml储备液(根据提取物浓度高低确定具体的量,使待测液原花青素浓度在0.05~0.20mg/ml范围内)定容至50ml,摇匀得到待测样品液。

(3) 样品测定:移取1.00ml待测液依照上述标准曲线绘制同样操作,测定OD550查标准曲线,并计算原花青素的含量。

5.结果计算

依照下列公式计算原花青素含量:

原花青素(mg/100g)=(c×V2×n)/{m×V1×(1-W)×1000}×100

c——查工作曲线样品液OD550对应的原花青素的含量(μg);
V1——待测样品液的取样体积(m1);
K——样品溶液的体积(m1);
m——样品称取的质量(g);
W——样品的含水量(%);
n——样品溶液稀释倍数。
结果保留3位有效数值。

6.注释

(1)线性范围:本法原花青素浓度在26.00~416.01μg范围内,与吸光值呈线性关系,其回归方程式为Y=3.033×10^(-3)x+0.027,相关系数r=0.9993。最低检出限为4μg。

(2)准确性:添加浓度为52.00~208.0μg的标准(OD550在0.157~0.520范围内),3次测定平均回收率在90.64%~109.5%。

(3)精密度(重现性):同一样品液8次测定,相对标准差(RSD)为2.13%~2.98%。

(4)干扰物质:比较紫外分光光度法,本法干扰物较少,常见的维生素、芦丁、类胡萝卜素、食品抗氧化剂、各类油脂类基体未见明显干扰,由于多糖、蛋白质不溶于无水乙醇,故不会干扰测定。

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