核黄素、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇高效液相色谱法

本方法适用于保健食品营养补充剂中的核黄素(riboflavin)、烟酸(nicotinic acid)、烟酰胺(nicotinamide)、盐酸吡哆醇(pyridoxine)的测定。

本方法的最低检出量：核黄素2.2ng，烟酸8.2ng，烟酰胺6.2ng，盐酸吡哆醇3.0ng。

1．方法提要

将粉碎均匀的片剂、胶囊或液体样品用提取液超声波提取和稀释，在高效液相色谱仪用C18柱分离，以紫外检测，用外标法定量。

2．仪器

高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波提取器、离心机。

3．试剂

(1)甲醇：分析纯、色谱纯。

(2)乙腈：色谱纯。

(3)磷酸：分析纯。

(4)1一癸烷磺酸钠(sodium1-decanesulfonate)离子对试剂。

(5)提取和稀释液：甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)。

(6)核黄素标准储备液：将标准品核黄素(纯度>99％)粉状结晶置于五氧化二磷干燥器中，24小时后，准确称取25mg，置于1L棕色容量瓶中，加入1.2ml冰乙酸和750ml水，将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，用水稀释至刻度，于冰箱中保存。

(7)烟酸标准储备液：准确称取干燥的标准品烟酸(纯度>99％)50.0mg，用水以超声波助溶并定容至50ml。

(8)烟酰胺标准储备液：准确称取干燥的标准品烟酰胺(纯度>99％)50.0mg，用水以超声波助溶并定容至50ml。

(9)盐酸吡哆醇标准储备液：准确称取干燥的标准品盐酸吡哆醇(纯度>99％)50.0mg，用水以超声波助溶并定容至50ml。

(10)混合标准使用液：临用前根据样液被测成分浓度需要，用甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)稀释成混合标准使用液。

4．测定步骤

(1)样品处理：取20粒以上的片剂或胶囊试样研磨混匀，称取一定量(准确至0．001g)，置于100ml棕色容量瓶中，用提取液约60ml超声波提取5min后，再加提取液至刻度，并稀释成合适的进样浓度，经0．45μm滤膜过滤后为样液(液体试样可直接用提取液稀释)。

(2)标准及样品测定：分别取混合标准使用液和样品液，在高效液相色谱仪中进样测定，并记录相应的峰面积，以外标法定量。

(3)色谱条件

色谱柱：Kromasil C18，250mm×4．6mm，5μm。

流动相：1一癸烷磺酸钠(1．229溶于850ml水)+乙腈+磷酸(850+150+1)。

检测波长：280nm。

流速：1．0ml／min。

进样量：10μl。

5．结果计算

X=(A1×C×V×F)/(A2×m×1000)

式中X——样品中单一成分的含量[mg／100g(mL)]；

A1——样品中单一成分峰面积；

c——标准溶液浓度(μg／ml)；

V——样品定容体积(ml)；

F——样液稀释倍数；

A2——标准溶液中单一成分峰面积；

m——样品质量(g或ml)；

1000——μg换算成mg的换算系数。

6．注释

(1)本方法出峰顺序为核黄素、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇，由于核黄素出峰居前，要注意样液中色素(如甜菜红)的干扰，最好能同时做阴性样品空白对照。

(2)标准溶液应现配，实验操作过程应避光。

(3)本方法线性范围：核黄素0．5～50．0μg／ml，烟酸1．0～100μg／ml，烟酰胺1．0～100μg／ml，盐酸吡哆醇0．5～50．0μg／ml。

(4)本方法平均回收率：核黄素99．6％，烟酸102．3％，烟酰胺100．3％，盐酸吡哆醇101．0％。

(5)精密度RSD：核黄素0．46％，烟酸3．2％，烟酰胺1．2％，盐酸吡哆醇0．62％。

维生素B2、烟酸、烟酰胺、维生素B6标准色谱图

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