本方法适用于保健食品营养补充剂中的核黄素(riboflavin)、烟酸(nicotinic acid)、烟酰胺(nicotinamide)、盐酸吡哆醇(pyridoxine)的测定。
本方法的最低检出量:核黄素2.2ng,烟酸8.2ng,烟酰胺6.2ng,盐酸吡哆醇3.0ng。
1.方法提要
将粉碎均匀的片剂、胶囊或液体样品用提取液超声波提取和稀释,在高效液相色谱仪用C18柱分离,以紫外检测,用外标法定量。
2.仪器
高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波提取器、离心机。
3.试剂
(1)甲醇:分析纯、色谱纯。
(2)乙腈:色谱纯。
(3)磷酸:分析纯。
(4)1一癸烷磺酸钠(sodium1-decanesulfonate)离子对试剂。
(5)提取和稀释液:甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)。
(6)核黄素标准储备液:将标准品核黄素(纯度>99%)粉状结晶置于五氧化二磷干燥器中,24小时后,准确称取25mg,置于1L棕色容量瓶中,加入1.2ml冰乙酸和750ml水,将容量瓶置于温水中摇动,待其溶解,冷至室温,用水稀释至刻度,于冰箱中保存。
(7)烟酸标准储备液:准确称取干燥的标准品烟酸(纯度>99%)50.0mg,用水以超声波助溶并定容至50ml。
(8)烟酰胺标准储备液:准确称取干燥的标准品烟酰胺(纯度>99%)50.0mg,用水以超声波助溶并定容至50ml。
(9)盐酸吡哆醇标准储备液:准确称取干燥的标准品盐酸吡哆醇(纯度>99%)50.0mg,用水以超声波助溶并定容至50ml。
(10)混合标准使用液:临用前根据样液被测成分浓度需要,用甲醇+水+磷酸(100+400+0.5)稀释成混合标准使用液。
4.测定步骤
(1)样品处理:取20粒以上的片剂或胶囊试样研磨混匀,称取一定量(准确至0.001g),置于100ml棕色容量瓶中,用提取液约60ml超声波提取5min后,再加提取液至刻度,并稀释成合适的进样浓度,经0.45μm滤膜过滤后为样液(液体试样可直接用提取液稀释)。
(2)标准及样品测定:分别取混合标准使用液和样品液,在高效液相色谱仪中进样测定,并记录相应的峰面积,以外标法定量。
(3)色谱条件
色谱柱:Kromasil C18,250mm×4.6mm,5μm。
流动相:1一癸烷磺酸钠(1.229溶于850ml水)+乙腈+磷酸(850+150+1)。
检测波长:280nm。
流速:1.0ml/min。
进样量:10μl。
5.结果计算
X=(A1×C×V×F)/(A2×m×1000)
式中X——样品中单一成分的含量[mg/100g(mL)];
A1——样品中单一成分峰面积;
c——标准溶液浓度(μg/ml);
V——样品定容体积(ml);
F——样液稀释倍数;
A2——标准溶液中单一成分峰面积;
m——样品质量(g或ml);
1000——μg换算成mg的换算系数。
6.注释
(1)本方法出峰顺序为核黄素、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇,由于核黄素出峰居前,要注意样液中色素(如甜菜红)的干扰,最好能同时做阴性样品空白对照。
(2)标准溶液应现配,实验操作过程应避光。
(3)本方法线性范围:核黄素0.5~50.0μg/ml,烟酸1.0~100μg/ml,烟酰胺1.0~100μg/ml,盐酸吡哆醇0.5~50.0μg/ml。
(4)本方法平均回收率:核黄素99.6%,烟酸102.3%,烟酰胺100.3%,盐酸吡哆醇101.0%。
(5)精密度RSD:核黄素0.46%,烟酸3.2%,烟酰胺1.2%,盐酸吡哆醇0.62%。
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