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白藜芦醇的高效液相色谱测定法(一)

2013-08-17    分类:检测方法    0人评论

 

本方法适用于葡萄酒以及其他植物和食品中白藜芦醇(resveratrol,3,4’,5一三羟基二苯乙烯)的测定。
本方法白藜芦醇的最低检出浓度为10ng/ml。

1.方法

提要白藜芦醇存在于葡萄、花生、桑椹等许多植物中,其中葡萄,尤其是葡萄皮中含量较高。目前葡萄酒中白藜芦醇的含量正逐渐被作为评价酒品质量的一个指标。白藜芦醇有顺式和反式两种异构体,在紫外光280、306nm处分别有最高吸收值,植物中通常以较稳定的反式形式存在。高效液相色谱测定葡萄酒中的白藜芦醇,酒样经前处理,用C18分析柱在紫外光306nm和280nm处分析,依据反式白藜芦醇标准在306nm处定量。

2.试剂

(1)乙酸乙酯(CH3COOC2H5)、碳酸氢钠(NaHCO3)、无水硫酸钠(Na2SO4)为国产分析纯,乙腈(Fisher公司)为色谱纯,实验用水为重蒸馏水。
(2)反式白藜芦醇标准品(Sigma公司)。
(3)反式白藜芦醇标准储备液:准确称取5mg反式白藜芦醇标准品,用乙腈溶解后定容至10ml,混匀备用。此溶液每1ml含反式白藜芦醇0.5mg。
(4)反式白藜芦醇标准使用液:准确吸取标准储备液0.1ml,用乙腈定容至10ml,混匀备用。此溶液每1ml含反式白藜芦醇5μg。

3.仪器

(1)高效液相色谱仪。
(2)旋转蒸发仪。

4.测定步骤

(1)样品处理:取葡萄酒100ml,用50ml乙酸乙酯提取3次,收集提取液,用3%的碳酸氢钠溶液洗涤3次,以重蒸馏水洗涤至溶液为中性,无水硫酸钠脱水,40%下真空减压浓缩至干,残留物用5.0ml乙腈溶解,备用。
(2)色谱条件
色谱柱:μ一Bondapak C18,300ram×3.9mm,Waters公司产品。
流动相:乙腈+水(40+60,V/V)。
流速:0.60ml/min。
检测波长:306nm和280nm。
柱温:室温。
迸样量:20μl。
(3)标准曲线的绘制:以白藜芦醇不同浓度标准溶液进样,得到相应峰高值,以浓度(μg/m1)为横坐标、峰高值(mm)为纵坐标绘制标准曲线,线性方程为Y=57.69x-0.42,相关系数r为0.9998。
(4)样品测定:准确吸取样品处理液和标准使用液各20μ1,注入高效色谱仪分离测定,根据反式白藜芦醇标准品峰的保留时间定性,根据其峰面积或峰高计算样品中反式白藜芦醇的含量。

5.结果计算

X=c×(S1/S2)×(V/m)×100

式中x——葡萄酒中反式白藜芦醇的含量(μg/100m1);
c——标准溶液的浓度(μg/m1);
S1——样品峰面积或峰高;
S2——标准溶液峰面积或峰高;
V——最终体积(m1);
m——取样量(m1)。

6.准确度和精密度

以中国红葡萄酒为样品,进行5次重复试验,其标准差为0.84,相对标准差(RSD)为3.5%。另取样品5份,分别加入20.2μg/lOOml标样1.Oml,处理同前,其回收率在90.0%~97.8%之间,标准差为3.88,相对标准差(RSD)为3.1%。

7.注释

(1) 白藜芦醇见光易分解,整个操作过程应避免阳光直射,并尽可能在暗室进行,且应在葡萄酒开封后立刻测定,以免其中的白藜芦醇发生氧化或异构化。

(2) 白藜芦醇在葡萄皮中含量较高,因而带皮发酵的红葡萄酒中含量高;仅以葡萄果汁发酵的白葡萄酒中含量低;采用葡萄原汁发酵的酒中含量高;而勾兑酒中含量微少。

306nm下红葡萄酒中白藜芦醇的色谱图

306nm下红葡萄酒中白藜芦醇的色谱图

280nm下红葡萄酒中白藜芦醇的色谱图

280nm下红葡萄酒中白藜芦醇的色谱图

 

(3)测定某品牌红葡萄酒中白藜芦醇,在306nm得到色谱图(图3—103)。根据标准的保留时间确定7.7min时出现反式白藜芦醇,紧随其后在8.9min时获得一个小峰。换至280nm,7.7min处的峰形变小,而8.9min处的峰形有显著增加(图3—104)。根据结构分析,顺式白藜芦醇的极性略小于反式白藜芦醇,在反相色谱中应在反式白藜芦醇的稍后出现,由此初步可以判断8.9min处为顺式白藜芦醇。

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