虫草素和腺苷的高效液相色谱测定法

本方法适用于保健食品中虫草素(ordyeepin)和腺苷(adenosine)的含量测定。
本方法虫草素和腺苷的检出限均为0．5ng。
本方法线性范围虫草素和腺苷均为0．25～25μg／ml。

1．方法

提要试样中的虫革素和腺苷经提取后在ODS色谱柱上分离，根据保留时间定性，用紫外检测器来测定虫草素和腺苷的含量。

2．仪器

高效液相色谱仪，带紫外检测器。

3．试剂

除非另有说明所有试剂均为分析纯，水为GB／T6682规定的一级水。
(1)甲醇：色谱纯。
(2)提取液：蒸馏水+甲醇(50+50，V／V)。
(3)虫草素和腺苷对照品：Sigma公司(纯度≥99％)。
(4)虫草素标准溶液和腺苷混合标准溶液(25．0μg／m1)：精确称取25mg虫草素和25mg腺苷，置于100ml容量瓶中，用提取液定容到刻度，即得虫草素和腺苷标准储备溶液，稀释10倍后得虫草素标准溶液和腺苷混合标准溶液。

4．测定步骤

(1)样品处理。
1)固体样品：称取样品0．2g(精确到0．1mg)，置于50ml容量瓶中，加入40ml提取液，超声波振荡30min，取出，冷却后用提取液定容到刻度，摇匀，经0．45μm微孔滤膜过滤，清液待分析。
2)液体样品：取均匀样品10ml，置于50ml容量瓶中，加入甲醇10ml，混匀，超声波振荡30min，取出，冷却后用提取液定容到刻度，摇匀，经0．45μm滤膜过滤，清液待分析。(2)标准工作曲线绘制：精密吸取虫草素和腺苷混合标准溶液(25．0μg／ml)1．0ml、10．0ml分别置于100ml容量瓶中，用提取液定容到刻度，摇匀，得到0．25μg／ml、2．50μg／ml虫草素和腺苷混合标准溶液。分别取10μl 0．25μg／ml、2．50μg／ml、25．0μg／ml标准工作系列溶液进样分析，以测得的虫草素和腺苷的峰面积分别对虫草素和腺苷的浓度绘制标准曲线。
(3)色谱条件

色谱柱：ODS液相色谱柱，150mm×4．6mm，5μm。

流动相：水+甲醇(88+12，V／V)。

流速：1．0ml／min。

柱温：室温。

紫外检测器波长：254nm。

(4)样品测定：取样品滤液10μl进液相色谱仪分离测定，根据色谱峰保留时间定性，以外标峰面积法进行定量。
(5)色谱图：腺苷和虫草素标准色谱图见图3—116，样品色谱图见图3—117。

腺苷和虫草素标准色谱图

腺苷和虫草素样品色谱图

5．结果计算

根据待测样品色谱峰面积，由标准回归方程式得样品液中虫草素和腺苷含量，计算出样品中的含量。样品色谱图样品中虫草素和腺苷含量按下式进行计算

X=(c×V×100)/(m×1000)

式中X——样品中虫草素和腺苷含量[mg／1009(mL)]；
c——进样液中虫草素和腺苷的浓度(μg／ml)；
V——样品的定容体积(ml)；
m——样品的取样量(g)。

6．注释

(1)虫草素的分子式为C10H13N5O3，分子量为251，针状或片状结晶，溶于水、热乙醇和甲醇，不溶于苯、乙醚和氯仿。虫草素在野生冬虫夏草中的含量极微，一般均是从蛹虫草中提取的。

(2)腺苷的分子式为C10H13N5O4，分子量为267，白色结晶性粉末或类白色结晶性粉末，溶于水，极难溶于乙醇。腺苷广泛存在于动物的肝脏以及冬虫夏草等生物体中，是一种遍布细胞的内源性核苷。

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