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核苷及其碱基的高效液相色谱测定法

2013-10-23    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于以冬虫夏草和灵芝为主的保健食品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷的测定。

本方法的检出限为尿嘧啶6ng,尿苷lOng,腺嘌呤16.7ng,腺苷16.7ng。

1.方法

提要冬虫夏草和灵芝中的尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤及腺苷用50%的乙醇超声波抽提后,于高效液相色谱中反相分离,紫外检测,以标准品的保留时间定性,以峰面积外标法定量。

2.仪器

(1) BIO—RAD高效液相色谱仪,1706多波长紫外检测器。

(2)超纯水装置:Milli—Q型。

(3)超声波提取器。

(4)溶剂微孑L过滤器(滤膜0.45μm)。

3.试剂

(1)甲醇:色谱纯。

(2)乙醇:分析纯。

(3)磷酸二氢钾:分析纯。

(4)水:三蒸水并经Milli—Q超纯处理。

(5)标准品尿嘧啶:中国科学院上海生物化学研究所。尿苷:中国科学院上海生物化学研究所。腺嘌呤:BDH公司。腺苷:中国科学院上海生物化学研究所。

(6)标准储备液:准确称取尿嘧啶30mg及尿苷、腺嘌呤、腺苷各50mg,分别置于50ml容量中,加纯水并超声波助溶,加水至刻度,混匀。

(7)单标使用液:将储备液用水稀释100倍(定性用)。

(8)混标使用液:分别准确吸取以下标准储备液(ml)(见表3—6),置于6个10ml容量瓶中,加纯水至刻度。

混标使用液配制表

混标使用液配制表

4.测定步骤

(1)样品处理

1) 胶囊、片剂、颗粒冲剂等固体粉末样品:准确称取0.5g左右粉末样品,置于25ml容量瓶中,加50%乙醇,于超声波提取器中超声波提取30min,取出,加50%乙醇至刻度,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液备用。

2) 口服液或虫草鸡精等液体样品:准确吸取5ml液体样品,置于25ml容量瓶中,用50%乙醇稀释,超声波提取10min取出,加50%乙醇定容至刻度,摇匀,用0.45μm微孑L滤膜过滤,滤液备用。

(2) 色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS2,200mm×4.6mm,5μm。

流动相:0.01mol/L磷酸二氢钾+甲醇(92+8,V/V)。

流速:1ml/min。

检测波长:260nm。

灵敏度:0.001。

进样量:10μl。

(3 )标准曲线的绘制:分别注入各种浓度的混标使用液10出于高效液相色谱仪中,以浓度及峰面积绘制标准曲线。线性浓度范围:尿嘧啶为1.8~18μg/ml,尿苷、腺嘌呤、腺苷为0.5~5.0μg/ml。

(4)样品测定:取供色谱测定的样品溶液10μl注入高效液相色谱仪中,以标准品的保留时间定性,以峰面积外标法定量。标准品色谱图见图3—114,样品色谱图见图3—115。

标准品及样品色谱图

标准品及样品色谱图

5.结果计算

X=(c×V)/(m×1000)

式中x——样品中核苷或碱基的含量[mg/g(ml)];
V——样品提取后定容的体积(ml);
c——从标准曲线查得样液中核苷或碱基的质量(μg);
m——样品的质量(g或ml)。

6.准确度与精密度

本法线性范围:尿嘧啶为1.8~18μg/ml,尿苷、腺嘌呤、腺苷为0.5~5.0μg/ml。在同一样品中用尿苷及腺苷两种浓度测加标回收率,尿苷为93.1%~96.8%,腺苷为93.8%~96.0%,相对标准偏差分别为4.0%和3.8%(n=6)。

7.注释

(1)冬虫夏草和灵芝是我国名贵的中草药,内含活性成分很多,其中常见的核苷类化合物就有十多种,但比较有代表性的是尿苷、腺苷及其碱基。本节介绍用HPLC法对保健品中尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、腺苷的分离测定。

(2)样品中核苷及其碱基的提取有用热提水浴回流法,但此法提取较繁琐,且杂质较多,经试验用高频超声波提取30min为佳,样品(液)如脂肪含量太高,可用乙醚(15ml×2)脱脂,乙醚用少量水洗,弃醚层,水层定容(或将水层蒸干,残渣用50%乙醇溶解定容至一定体积)后为样液。

(3)流动相的pH对核苷或其碱基的分离影响比较大,如尿嘧啶峰前杂质比较多,可调节流动相醇水比例以排除干扰。

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