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番茄红素的高效液相色谱测定法

2013-11-08    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于同时满足下列要求的样品:①以番茄及其制品(如番茄酱)和其萃取物、三孢布拉霉萃取物或人工合成品为原料制成;②以番茄红素为功能因子或标志性成分。

1.方法提要

在C18一HPLC—PDA上,样品中的番茄红素被分离,根据其与参比样品的色谱行为和光谱特征比较,样品中的番茄红素组分被鉴定,采用外标法,对番茄红素进行定量测定。

2.试剂

分析纯试剂:丙酮、二氯甲烷、石油醚(BP60%~90℃)、正己烷。色谱纯试剂:乙酸乙酯和乙腈。经逆流渗透纯化的超纯水。番茄红素参比样品:Sigma公司,P/NL9879,纯度90%~95%(w/w)。

3.仪器设备

(1)分析天平(0.00001g)。

(2)超声波水槽(70W)。

(3)水浴锅。

(4)离心机(10000r/min)。

(5)二元梯度HPLC,配备二极管阵列检测器(PDA)。色谱柱:Diamonsil州柱(250mm×4.6mm,5μm)。

4.测定步骤

(1) 番茄红素参比样品储备液的配制:准确称取番茄红素参比样品1mg(准确至0.00001g),加入1ml二氯甲烷溶解,转移至25ml棕色容量瓶中,用石油醚定容,配制成40μg/ml的储备液,在建议的条件下贮存和期限内使用石油醚配成工作液,用于HPLC分析。如果超期,不建议使用。

(2)样品制备

1) 软胶囊内容物:取50粒胶囊内容物在55℃水浴中混合均匀,准确(至0.0002g)称取混合物0.1g,置于50ml锥形瓶中,加入5~10ml的二氯甲烷,超声波(70W)处理10min,使其完全溶解,将溶液移入100ml棕色容量瓶中,用石油醚定容。移取2ml溶液于50ml棕色容量瓶中,用石油醚定容。分析前静置30min,取上清液4ml,用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。

2) 硬胶囊内容物、片剂和粉剂:硬胶囊内容物、片剂和粉剂的主要成分为微胶囊包埋粉。片剂在萃取前用咖啡磨粉碎,收集小于40目的粉末进行萃取。准确(至0.00002g)称取番茄红素含量为1%(w/w)的粉剂或片剂粉末(≤40目)0.02g,溶于5ml蒸馏水中,超声波(70W)处理6~8次,累计10min,加入正己烷5ml,充分混匀,转移至25ml分液漏斗中,静置10min,收集上相。再用5ml正己烷重复萃取下相4次,收集萃取液,合并上相,定容至25ml。取上清液4ml,10000r/min离心3min,上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。

3)色谱条件:C18固定相:DIAMONSIL 柱(250mm×4,6mm,5μm);流动相A:乙腈+水(9+1,V/V);流动相B:乙酸乙酯;线性梯度洗脱:在15min内,B由0增至100%,随后B保持在100%5min;流速:1.0ml/min;PDA检测波长:260~550nm;色谱图检测波长:471Dill;进样量:20μl;柱温:室温。

(4) 质量浓度一峰面积回归曲线:准确取一定体积的番茄红素参比样品储备液,用加倍稀释的方法配制成10个不同质量浓度的标准样品液,分别为0μg/ml、0.020μg/ml、0.391μg/ml、0.781μg/ml、0.156μg/ml、0.313μg/ml、0.625μg/ml、1.250μg/ml、2.500μg/ml、5.000μg/ml。各取20μl进样,在每个色谱图上,对番茄红素组分峰积分,得到峰面积,做线性回归,得到质量浓度一峰面积线性回归曲线,计算R2值。

(5) 样品测定:根据其色谱行为和光谱特征与参比样品的比较,鉴定番茄红素组分。根据组分的峰面积,从参比样品的质量浓度一峰面积回归曲线计算样品中番茄红素的含量。

5.结果计算

(1) 参比样品的色谱行为和光谱特征:图3—164为参比样品的色谱图。图3—165为组分I的电子吸收光谱图,最大吸收波长为474nm。

番茄红素参比样品的C18一HPLC色谱图

番茄红素参比样品的C18一HPLC色谱图

组分I的电子吸收光谱图(溶剂:HPLC流动相)

组分I的电子吸收光谱图(溶剂:HPLC流动相)

(2) 质量浓度一峰面积回归曲线:在C18一HPLC—PDA上,测定10个不同质量浓度的参比样品,得到线性回归曲线,回归方程为Y=24693x,R2=0.9994,线性范围为0.1~5μg/ml。

(3)番茄红素软胶囊内容物的C18-HPLC分析:图3—166为番茄红素软胶囊内容物萃取物的C18一HPLC色谱图。根据其色谱行为和光谱特征与参比样品的比较,组分I鉴定为番茄红素。测定该组分波长的峰面积,根据质量浓度一峰面积线性回归方程,计算各样品中番茄红素的含量。

6.注释

(1)番茄红素的命名与结构特征:番茄红素是一种不含氧的开环类胡萝卜素(见图3—167),其中文习惯命名为番茄红素,英文习惯命名为lycopene,中文半系统命名为中,ψ一胡萝卜素,英文半系统命名为ψ,ψ一carotene,分子式为C40H56分子量为536.85。由于其中存在多个双键,番茄红素分子普遍存在几何异构现象。

番茄红素软胶囊内容物萃取物的C18一HPLC色谱图

番茄红素软胶囊内容物萃取物的C18一HPLC色谱图

(2)方法的意义:目前,市场上番茄红素功能因子的来源主要包括天然产物、生物合成品和人工合成品。天然产物的主要原料为番茄及其制品,根据萃取方法分成有机溶剂法产品和超临界流体萃取法产品。生物合成产品主要由三孢布拉霉经发酵制成。本节所述方法可以满足现阶段对这些产品检测的需求。

(3)注意事项:在实验室中,本方法需达到如下的要求:①番茄红素的检出限为0.02μg/ml;②对某一样品平行测定6次,样品浓度结果的相对标准偏差(RSD)≤3%;③添加外标法测定的回收率≥99%。

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