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叶黄素的高效液相色谱测定法(一)

2013-11-05    分类:检测方法    0人评论

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本方法适用于保健食品营养补充剂中叶黄素(lutein)的测定。

本方法叶黄素的检出限为2.7ng/ml。

1.方法提要

样品中的叶黄素用无水乙醇抽提后,在高效液相色谱仪中446nm处检测,以外标法定量。

2.仪器

高效液相色谱仪、紫外检测器、超声波提取器、旋涡混合器、离心机(10000r/min)、紫外分光光度计。

3.试剂

叶黄素标准品:Fluka公司,90%(HPLC);乙腈(色谱纯);甲醇(色谱纯);二氯甲烷(AR);无水乙醇(HPLC级);超纯水。

4.测定步骤

(1) 样品处理:将20粒以上的胶囊内容物,充分混合均匀,准确称取适量样品约1.000g,置于lOOml棕色容量瓶中,加5ml 60℃的水,于60℃水浴中超声波提取5min,冷却后,加无水乙醇至100ml刻度,在旋涡混合器中充分振荡均匀,静置,吸取上清液置于小塑料离心管中,10000r/min离心3min,取出一定量(0.20~0.5ml)上清液置于10ml具塞试管中,用高纯氮气小心吹干,加1.0ml甲醇溶解,在HPLC中进样测定。

(2) 标准溶液的标定和配制:取叶黄素标准品约1mg,用无水乙醇溶解并定容在5ml棕色容量瓶中,用下法标定其准确浓度:准确吸取0.06ml标准溶液,加于5.0ml无水乙醇中,用紫外分光光度计以无水乙醇调零点,用10m比色皿于446nm处测定吸光度值(吸光度值约在0.4左右),并计算叶黄素标准液的浓度。平行测定三份,取均值。

叶黄素(μg/ml)=(A×5.06)/(0.2560×0.06)

式中A——标准溶液在446nm处的吸光度值;

0.2560——叶黄素在无水乙醇溶液中,入射光波长446nm,比色皿厚度为1cm,溶液浓度为1mg/L的吸光系数;

5.06/0.06——测定过程中稀释倍数的换算系数。

(3 )色谱条件

色谱柱:Kromasil 100 AC18,250mm×4.6mm,5μm。

流动相:乙腈+二氯甲烷+甲醇(85+10+5,V/V/V)。

检测波长:446nm。

流速:0.8ml/min。

进样量:10μl。

(4) 测定:分别吸取2.0μg/ml、6.0μg/ml、10.0μg/ml、14.0μg/ml、18.0μg/ml的标准使用液及样品液各10μl,注入高效液相色谱仪中进行分离,以标准溶液出峰的保留时间定性,记录相应的峰面积,绘制标准曲线图,以外标法定量。

5.结果计算

X=(c×V1×100)/(m×V2×1000)

叶黄素标准曲线图

叶黄素标准曲线图

式中X——样品中叶黄素的含量(mg/100g);

c——从标准曲线查得样液中叶黄素的浓度(μg/ml);

m——样品质量(g);

E——样品定容体积(ml);

K——样品测定液体积(ml);

1000——μg转换成mg的换算系数。

6.注释

(1) 本方法线性范围为2.0~18.0μg/ml。Y=308389x+23829,r=0.9989。

(2) 本方法平均回收率为97.8%。

(3) 精密度RSD为3.2%(n=6)。

(4)如样品添加的为微胶囊化叶黄素,提取时要先加5ml60%的水,并在60℃的水浴中超声波提取5min,使微胶囊外壳的有机膜溶解,令叶黄素析出,再用有机溶剂提取。实验证明,如用有机溶剂直接提此类样品的叶黄素,只相当于前者的85%。对非微胶囊化的叶黄素则应用有机溶剂直接提取。

(5)本样品为添加叶黄素的营养素补充剂,并非天然的结合型的类胡萝b素,样品中脂质较少,曾用三种有机溶剂提取,提取率高低为无水乙醇>丙酮>石油醚+丙酮(1+1),所以选用无水乙醇为提取溶剂。

(6)叶黄素同属类胡萝b素,见光、遇氧容易破坏,样品的提取及分析过程应在弱光中操作,如处理大量样品可加0.1g的二丁基羟甲基苯,标准溶液应及时标定。

(7)附:某胶囊样品叶黄素标准及样品色谱图(图3—152、3—153)。

叶黄素色谱图

叶黄素色谱图

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