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叶黄素的高效液相色谱测定法(三)

2013-11-07    分类:检测方法    0人评论

适用于本方法的检测样品需同时满足下列要求:①以万寿菊萃取物为原料制成;②以叶黄素为功能因子或标志性成分;③样品中含有一定量的玉米黄素。

1.方法提要

来自于万寿菊花瓣萃取物中的叶黄素酯经过碱性水解(皂化)形成叶黄素单体。在C18一HPLC—PDA上,叶黄素和玉米黄素可形成一个峰,该峰与未完全水解的酯和其他类胡萝卜素被分离。根据其与叶黄素参比样品的色谱行为和光谱特征比较,该组分可被鉴定。在此色谱条件下,测定样品中叶黄素与玉米黄素混合组分峰面积,并绘制叶黄素参比样品的质量浓度一峰面积标准曲线,据此计算样品中叶黄素和玉米黄素的总含量。

在C30一HPLC—PDA上,叶黄素、玉米黄素、未完全水解的酯和其他类胡萝t-素可被分离。根据其与参比样品的色谱行为和光谱特征比较,叶黄素全反式异构体组分可被鉴定。在此色谱条件下,根据叶黄素全反式异构体和玉米黄素全反式异构体组分的峰面积,按式①和②计算样品中叶黄素全反式异构体的相对和绝对含量。

①叶黄素全反式异构体相对含量(%)=叶黄素全反式异构体峰面积/(叶黄素全反式异构体峰面积+玉米黄素全反式异构体峰面积)

②叶黄素全反式异构体绝对含量=叶黄素和玉米黄素含量(C18一HPLC法)x叶黄素全反式异构体相对含量

2.试剂

(1) 分析纯试剂:丙酮、二氯甲烷、元水乙醇、甲苯、正己烷、甲醇、乙醚、石油醚(BP60℃~90℃

(2)、无水硫酸钠、氢氧化钾、抗坏血酸。

(2)色谱纯试剂:乙腈、乙酸乙酯、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE)。

(3)经过逆流渗透纯化的超纯水。

(4)参比样品

1) 叶黄素参比样品:下列两种产品可择一使用。Sigma公司(P/N:95507),含量约90%(W/W)。Fluka公司,含量90%(HPLC)。

2) 玉米黄素参比样品:Sigma公司(P/N:14681),含量>95%(w/w)。

3.仪器设备

(1)分析天平(0.00001g)。

(2)磁力搅拌器和转子。

(3)水浴锅。

(4)超声波水槽(70W)。

(5)离心机(10000r/min)。

(6)二元梯度洗脱HPLC,配备二极管阵列检测器(PDA),色谱柱:Diamonsil 柱,4.6mm×250mm,5μm。YMCCarotenoidS一5,4.6mm×250mm,5μm。

(7)UV—VIS分光光度计。

4.测定步骤

(1) 参比样品储备液的配制

1) 叶黄素参比样品储备液:准确称取叶黄素参比样品1mg(准确至0.00001g),加入1ml丙酮,转移至25ml棕色容量瓶中,随后用丙酮溶解并定容至50ml,配制成40μg/ml的储备液,充氮后保存于一20℃冰箱中。24小时内使用丙酮配制成浓度适合的工作液,用于HPLC分析。

2) 玉米黄素参比样品储备液:准确称取玉米黄素参比样品1mg(准确至0.0001g),加入1ml丙酮,转移至25ml棕色容量瓶中,用丙酮定容,配制成40pg/ml的储备液,充氮后保存于一20℃冰箱中。24小时内使用丙酮配制成浓度适合的工作液,用于HPLC分析。上述叶黄素和玉米黄素储备液的存储条件和期限同“4.(1)1)叶黄素参比样品储备液”。当储备液的储存时间超过储存期限后不建议使用。

(2)溶液配制

1)用于软胶囊内容物分析:正己烷一无水乙醇一丙酮一甲苯(10+6+7+7,V/V/V/V)溶液100ml;40%氢氧化钾一甲醇溶液10ml;10%无水硫酸钠溶液250ml。

2)用于硬胶囊内容物等分析:50%氢氧化钾溶液30ml;乙醚一石油醚溶液(1+1,V/V)500ml。

(3)样品制备

1) 叶黄素单体样品

软胶囊内容物:取50粒胶囊内容物混合均匀,在水浴中加热至55℃,充分搅拌均匀,随后准确(至0.0002g)称取叶黄素含量约10%(w/w)的胶囊内容物0.1g,置于50ml锥形瓶中,加入5~10ml丙酮,超声波处理10min,使其完全溶解,将溶液移入100ml棕色容量瓶中,用丙酮定容,混匀。移取2ml溶液于50ml棕色容量瓶中,用丙酮定容,摇匀,静置30min,取上清液,用0.45μm微孑L滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。硬胶囊内容物、片剂和粉剂:硬胶囊内容物、片剂和粉剂的主要成分为微胶囊包埋粉。硬胶囊内容物的取样:取50粒硬胶囊内容物,搅拌混匀,随机取粉末进行萃取。片剂样品的取样:取50粒片剂,在萃取前用咖啡磨粉碎,收集小于40目的粉末进行萃取。准确(至0.0002g)称取叶黄素含量≥I%(W/w)的微胶囊包埋粉或片剂粉末0.02g,溶于5ml蒸馏水中,超声波(70W)处理6—8次,累计10min,加入正己烷5ml,充分混匀,转移至分液漏斗中,静置10min,收集上相。再用5ml正己烷重复萃取下相4次,收集萃取液,合并上相,定容至25ml。取上清液4ml,10000r/min离心3min,上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。

2) 叶黄素酯样品

对于以叶黄素酯为主要功效成分的样品,需要将其中的叶黄素酯在强碱性条件下水解(皂化),然后测定其中叶黄素单体的含量。在这一皂化反应中,影响叶黄素分子稳定性的因素较多,因此,建议对每份样品做平行处理,取平均值计算结果。软胶囊内容物:取200粒胶囊内容物(大约100g),在56℃水浴中加热10min,确保样品完全呈流动状,充分搅拌直到均质。准确(至0.0002g)称取0.05g,放入100ml棕色容量瓶中。取30ml稀释液,加入容量瓶中,振荡1min。在容量瓶中加入2ml氢氧化钾一甲醇溶液,振荡1min,将容量瓶放入56℃的水浴中20min。在水浴过程中阻止溶剂挥发的空气冷凝装置是一个橡皮塞,在橡皮塞上开洞,接一根长玻璃管。玻璃管在瓶口上端的部分至少有45cm长,下端至少超出橡胶塞0.5cm。随后,在冷水中冷却样品5min。向容量瓶中加入30ml正己烷,振荡1min,用10%的Na2SO4溶液定容到刻度,剧烈振荡1min后,在暗中静置1小时。移取1ml上相清液至50ml容量瓶中,用正己烷稀释并定容到刻度。取上清液4ml,10000r/min离心3min,用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液用于HPLC分析。硬胶囊内容物、片剂和粉剂:准确(至0.00019)称取约250mg粉剂,置于150ml圆底烧瓶中,加入5ml水,0.5g抗坏血酸,摇匀,加入30ml无水乙醇,摇匀至颗粒分散,再加入10ml氢氧化钾溶液,摇匀,于75℃水浴中保温30min,取出后冷却。将皂化液移入250m1分液漏斗中,用少量水冲洗皂化瓶,冲洗液并入分液漏斗中。用50ml乙醚一石油醚溶液冲洗皂化瓶及残渣,并入分液漏斗中,振摇2min,静置分层,水层再用50ml乙醚+石油醚溶液萃取,合并醚层。每次用水约50ml洗涤醚层,用pH试纸检验直到水层中性。将醚层倒入100ml圆底烧瓶中,于55℃减压蒸馏到2ml,用氮气吹干,加入10ml无水乙醇,充分混合。根据分析需要,再取此溶液用无水乙醇稀释,得分析液。分析液过0.45μm微孔滤膜,供HPLC分析。

(4) 质量浓度一峰面积回归曲线:准确取一定体积的浓度为40斗g/ml的叶黄素参比样品丙酮储备液,用加倍稀释的方法配制成9个不同质量浓度的参比样品丙酮溶液,分别为0μg/ml、0.039μg/ml、0.078μg/ml、0.156μg/ml、0.313μg/ml、0.625μg/ml、1.250μg/ml、2.500μg/ml、5.000μg/ml。在C18一HPLC上测定各样品在A=450nm处色谱图上叶黄素组分的峰面积,做线性回归,得到质量浓度一峰面积线性回归曲线,计算R2值。

(5) 样品中叶黄素和玉米黄素总含量的C18一HPLC测定色谱条件:

色谱柱:Diamonsil (4.6mm×250mm,5μm);

流动相A:乙腈+水(9+1,V/V);

流动相B:乙酸乙酯;

线性梯度洗脱:B在15min内由0增加至100%;

流速:1.0ml/min;

检测波长:450nm;

PDA光谱收集范围:260~600nm;

进样量:20μl。

根据其色谱行为和光谱特征对各组分进行定性,在450nm的色谱图上计算叶黄素和玉米黄素组分的总峰面积,根据叶黄素的质量浓度一峰面积线性回归方程,计算样品中叶黄素和玉米黄素的总含量。

(6)样品中叶黄素含量的C18一HPLC测定色谱条件:色谱柱:YMCCarotenoidS一5(4.6mm×250mrn,5μm);流动相A:乙腈+甲醇(75+25,V/V);流动相B:MTBE;线性梯度洗脱:B在20min内由0增加至55%;流速:1.0ml/min;检测波长:450nm;PDA光谱收集范围260~600nm;进样量:20ml。根据样品中全反式叶黄素和玉米黄素组分的保留时间与参比样品的一致性,以及二者光谱特征与参比样品的比较,对二者定性。在450nm的色谱图上分别计算叶黄素和玉米黄素组分的峰面积,根据式①和②计算叶黄素全反式异构体的相对和绝对含量。

5.结果计算

(1)叶黄素参比样品的C18一HPLC分离:图3—155为叶黄素参比样品的色谱图。图3—156为组分I的电子吸收光谱图,最大吸收波长为448nm。

叶黄素参比样品的色谱图

叶黄素参比样品的色谱图

 

组分I的电子吸收光谱图

组分I的电子吸收光谱图

(2)叶黄素参比样品的质量浓度一峰面积回归曲线:在C18一HPLC—PDA上,测定9个不同质量浓度参比样品峰面积,得到回归曲线,回归方程为Y=22605x,R2=0.998,线性范围为0.1~5μg/ml。

(3)叶黄素和玉米黄素总含量的测定:图3—157为万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物溶液的C18一HPLC色谱图。经与叶黄素和玉米黄素参比样品的保留时间和电子吸收光谱特征比较,组分I被鉴定为叶黄素和玉米黄素图3—156组分I的电子吸收光谱图(溶剂:流动相)混合组分。测定该组分的峰面积,根据质量浓度一峰面积线性回归曲线,计算样品中叶黄素的含量。

万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物的C18一HPLC色谱图

万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物的C18一HPLC色谱图

(4)叶黄素和玉米黄素参比样品的C18一HPLC分离:图3—158为等浓度叶黄素和玉米黄素参比样品混合物的色谱图。图3—159为组分I和Ⅱ的电子吸收光谱图,二者见电子吸收光谱特征比较表3—10。

等浓度叶黄素和玉米黄素参比样品混合物的色谱图

等浓度叶黄素和玉米黄素参比样品混合物的色谱图

组分I和Ⅱ的电子吸收光谱图

组分I和Ⅱ的电子吸收光谱图

电子吸收光谱特征比较

电子吸收光谱特征比较

(5) 皂化物中叶黄素的检测:图3—160为万寿菊花瓣萃取物皂化物的C18一HPLC色谱图。根据其保留时间和光谱特征与参比样品的比较,组分I鉴定为叶黄素全反式异构体,组分Ⅱ为玉米黄素全反式异构体。在色谱图上分别测定组分I和Ⅱ的峰面积。按式①计算叶黄素全反式异构体的相对含量,按式②计算叶黄素全反式异构体的绝对含量。保留时间图3—160万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物的C18一HPLC色谱图[组分鉴定:I为全反式叶黄素;Ⅱ为全反式玉米黄索]

万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物的C18一HPLC色谱图[组分鉴定

万寿菊干花正己烷萃取物皂化产物的C18一HPLC色谱图

 

 

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