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叶黄素的高效液相色谱测定法(二)

2013-11-06    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于含叶黄素酯的保健食品中叶黄素含量的测定。

本方法叶黄素的检出限为3ng。

本方法线性范围为1.0~10μg/ml。

1.方法提要

试样经皂化一萃取法提取叶黄素,在高效反相色谱C18柱上分离,用紫外检测器检测,以外标法定量。

2.仪器

高效液相色谱仪,带紫外检测器。

3.试剂

除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。

(1)50%(M/M)氢氧化钾溶液:称取509氢氧化钠(分析纯),加509去离子水溶解。

(2)甲醇:色谱纯。

(3)乙腈:色谱纯。

(4)无水乙醇。

(5)抗坏血酸。

(6)乙醚+石油醚溶液:乙醚+石油醚=1+1(V+V)。

(7)叶黄素对照品:Fluka公司,纯度90%。

(8)叶黄素标准溶液(10μg/ml):精密称取叶黄素标准品约0.0010g,移人100ml容量瓶中,加入20ml无水乙醇,60%超声波溶解5min,冷却后并用无水乙醇定容到100ml,成浓度约为10μg/ml的标准溶液。标准溶液应进行测定校准。用1cm比色皿,以无水乙醇作为空白,在445nm处测定标准溶液的吸收度Amax。标准溶液的浓度为:

X(μg/ml)= (Amax ×10000)/2550

4.测定步骤

(1) 样品处理

1) 皂化:准确称取约250mg样品(精确至0.1mg),置于150ml圆底烧瓶中,加入5ml水,0.5g抗坏血酸,摇匀,加入30ml无水乙醇,摇匀到颗粒分散,再加入10ml氢氧化钾溶液摇匀,于75℃水浴皂化30min,取出后冷却。

2) 提取:将皂化好的样品移入250ml分液漏斗中,用少量水洗涤皂化瓶,洗液并入分液漏斗中。用50ml乙醚+石油醚溶液洗涤皂化瓶及残渣,并人分液漏斗中,振摇2min,静置分层,水层再用50ml乙醚+石油醚溶液萃取,合并醚层。

3) 洗涤:每次用水约50ml洗涤醚层,用pH试纸检验直到水层中性。

4) 浓缩:将醚层倒入100ml圆底烧瓶中,于55℃减压蒸馏到2rnl,用氮气吹干,加入10ml无水乙醇,充分混合,根据分析需要,再取此溶液用无水乙醇稀释,得分析液。分析液过0.45μm微孑L滤膜,待用。

(2) 标准工作曲线制作:取叶黄素标准溶液(10μg/ml)配制成1.0μg/ml、5.0μg/ml、10μg/ml标准工作系列溶液进样分析,以测得的叶黄素的峰面积分别对叶黄素的浓度绘制标准曲线。

(3) 色谱条件

色谱柱:Pursuit C18液相色谱柱,250mm×4.6mm,5μm。

流动相:甲醇+乙腈+色谱用水(10+9+1,V/V/V)。

流速:1ml/min。

柱温:35℃。

检测波长:446nm。

(4) 样品测定:取样品滤液10μl进液相色谱仪分离测定,根据色谱峰保留时间定性,以外标峰面积法进行定量。

(5)色谱图:叶黄素标准色谱图见图3—154

图3—154 叶黄素标准色谱图

图3—154 叶黄素标准色谱图

5.结果计算

根据待测样品色谱峰面积,由标准回归方程式得样液中叶黄素含量,计算出样品中的含量。样品中叶黄素含量按下式进行计算:

X=(c×V×100)/(m×1000×1000)

式中X——样品中叶黄素含量(g/100g);

c——进样液中叶黄素的浓度(μg/ml);

V——样品的定容体积(ml);

m——样品的取样量(g)。

6.注释

(1 )叶黄素的化学名称为3,3’一二羟基一d一胡萝卜素,分子式为C49H56O2。它不溶于水,易溶于油脂和脂肪性溶剂。纯的叶黄素为棱格状黄色晶体,有金属光泽,对光和氧不稳定,需贮存于阴凉干燥处,避光密封。

(2)样品前处理需避光。

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