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儿茶素的高效液相色谱测定法

2013-10-07    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于茶类保健食品中儿茶素含量的测定。

本方法检出限:表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)均为0.02μg。

本方法线性范围:表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)均为20~500μg/ml。

1.方法提要

试样中的儿茶素经提取后在苯基己基色谱柱上分离,根据保留时间定性,用紫外检测器测定儿茶素的含量。

2.仪器

高效液相色谱仪带紫外检测器。

3.试剂

除非另有说明,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
(1)乙腈:色谱纯。
(2)甲醇:色谱纯。
(3)提取液:水+甲醇(30+70,V/V)。
(4)乙酸。
(5)乙二胺四乙酸钠溶液(10mg/ml):称取1.09乙二胺四乙酸钠(精确到1mg),置于100ml容量瓶中,加入50ml热水,超声溶解,冷却后用水定容到刻度,混匀。溶液需临用现配。
(6)抗坏血酸溶液(10mg/m1):称取1.0g抗坏血酸(精确到1mg),置于100ml容量瓶中,加入水,超声溶解,冷却后用水定容到刻度,混匀。溶液需临用现配。
(7)稳定溶液[含乙二胺四乙酸钠(500wg/m1)和抗坏血酸(5001.zg/m1)的10%(V/V)的乙腈水溶液]:吸取25ml乙二胺四乙酸钠(10mg/m1)和25ml抗坏血酸(10mg/m1),置于500ml容量瓶中,加入50ml乙腈,用水定容到刻度,混匀。溶液需临用现配。
(8)流动相
1)流动相A[2%(V/V)的乙酸水溶液(含20μg/ml乙二胺四乙酸钠)]:吸取20ml乙酸和2ml乙二胺四乙酸钠(10mg/m1)溶液,置于1000ml容量瓶中,用水定容到刻度,混匀。溶液经微孑L滤膜过滤,待用。
2)流动相B[2%(V/V)的乙酸的乙腈溶液(含20ixg/ml乙二胺四乙酸钠)]:吸取20ml乙酸和2ml乙二胺四乙酸钠(10mg/m1)溶液于1000ml容量瓶中,用乙腈定容到刻度,混匀。溶液经微孑L滤膜过滤,待用。
(9)七种儿茶素对照品:表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C),Sigma公司产品(纯度≥98%)。
(10)儿茶素混合储备溶液(1.0mg/m1):精确称取七种儿茶素对照品各10mg,用水定容至10.00ml,即得儿茶素混合储备溶液(1.0mg/m1)。

4.测定步骤

(1)样品处理
1)速溶茶类:称取0.5g(精确到0.1mg)样品,置于50ral容量瓶中,加入25ml60℃热水,超声振荡5min,取出,冷却后加5ml乙腈,用水定容到50ml,摇匀。
2)叶茶类:称取0.2g(精确到0.1mg)样品,置于lOml有刻度的玻璃离心管中,加入5ml 70℃左右的提取液,摇匀,70℃水浴10min,每5min振摇一次。取出离心管,冷却后3500r/min离心10min。取上清液加入lOml容量瓶中,用常温的提取液定容到刻度,摇匀。
3)取2ml速溶茶类或叶茶类的提取液,置于50ml容量瓶中,用稳定溶液定容到刻度,摇匀后经0.45斗m滤膜过滤,清液待分析。
(2)标准曲线制作:精密吸取儿茶素混合储备溶液,用稳定溶液逐级稀释并配制标准工作系列溶液,其浓度分别为20.0μg/ml、50.0μg/ml、500μg/ml,取lOμl进样分析,以测得的每种儿茶素的峰面积分别对其浓度绘制标准曲线。
(3)色谱条件
色谱柱:Phenomenex Luna,Phenyl—Hexyl色谱柱,250mm×4.6mm,5Ixm。
流动相(A+B)梯度洗脱体系:0~5min:92%A;5~20min:92%A~82%A;20~25min:82%A~50%A;25~30min:50%A;30~38min:50%A~92%A。
流速:1.0ml/min。
柱温:室温。紫外检测器波长:278nm。
(4)样品测定:取样品滤液10斗l进液相色谱仪分离测定,根据色谱峰保留时间定性,用外标峰面积法进行定量。
(5)色谱图图3—36七种儿茶素和咖啡因的标准色谱图

儿茶素标品色谱图

儿茶素标品色谱图

5.结果计算

根据待测样品色谱峰面积,由标准回归方程式中得样品液中每种儿茶素含量,计算出样品中的每种儿茶素含量。样品中每种儿茶素含量按下式进行计算。

X=(c×V×100)/(m×1000×1000)

儿茶素样品色谱图

儿茶素样品色谱图

式中x——样品中每种儿茶素含量[g/100g(ml)];
c——样品液中儿茶素的浓度(μg/ml);
V——样品的定容体积(ml);
m——样品的取样量(g)。
七种茶素含量的总和即为样品的儿茶素含量。

6.注释

(1)儿茶素类属于多元酚类中的一种,是以儿茶素为主体结构与没食子酸基团结合形成的一类活性物质。它主要由表没食子儿茶素(EGC)、没食子儿茶素(GC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、儿茶素(C)等几种成分组成。它可溶于热水、乙醇、冰醋酸和丙酮,不溶于苯、氯仿和石油醚。儿茶素类是茶叶的重要成分。
(2)标准工作系列溶液在一20℃的情况下可保存两个月。样品提取液在4℃的情况下可保存24小时。
(3)本方法可同时测定咖啡因。

 

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