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腺苷的高效液相色谱测定法

2013-10-23    分类:医药中间体    0人评论

本方法适用于以冬虫夏草为主要原料的保健食品中腺苷(adenosine)的测定。

本方法腺苷的检出限为12.5ng。

1.方法

提要样品中的腺苷用一定浓度的甲醇超声波提取,以反相液相色谱分离,与标准品的保留时间比较定性,以峰面积外标法定量。

2.仪器

(1) 高效液相色谱仪,配有紫外检测器和色谱工作站。

(2)超纯水装置。

(3)超声波提取器。

(4)微孔过滤器(滤膜0.45μm)。

3.试剂

所用试剂除特殊说明外均为分析纯,实验用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。

(1) 无水乙醇

(2) 甲醇。

(3) 磷酸二氢钾。

(4) 腺苷标准储备液:准确称取腺苷标准品(Sigma公司)50.0mg,加超纯水溶解并定容至50ml,混匀,置冰箱内保存。此溶液每1ml含腺苷1.0mg。

(5)腺苷标准使用液:准确吸取腺苷标准储备液5.0ml,置于50ml容量瓶中,用超纯水稀释至刻度,混匀。此溶液每1ml含腺苷100.0μg。

4.测定步骤

(1) 样品处理:准确称取固体样品0.59左右(液体样品5.0ml),置于25ml容量瓶中,加无水乙醇15ml、水10ml(液体样品应扣除样品体积),以超声波提取10min左右,取出,加水定容至25ml,摇匀,用0.45μm微孔滤膜过滤,滤液供液相色谱分析用。

(2) 色谱条件

色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm。

流动相:乙腈+0.010mol/L磷酸二氢钾(8+92,V/V)。

检测波长:254nm。

灵敏度:0.02AUFS。

流速:1.0ml/min。

进样量:10μl。

(3) 标准曲线的绘制:准确吸取标准使用液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml,分别置于10ml容量瓶中,用超纯水稀释至刻度,混匀后,分别取10μ1注入高效液相色谱仪中分离测定,以峰面积对浓度绘制标准曲线。标准曲线浓度为10.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、40.0μg/ml、50.0μg/ml。回归方程Y=145.67x一169.49,r=0.9995。

(4) 样品测定:取样品处理液10μ1,注入色谱中分离测定,与标准品的保留时间比较定性,以峰面积外标法定量。腺苷标准色谱图见图3—111,样品色谱图见图3—112,腺苷标准曲线见图3—113。

腺苷标准色谱图

腺苷标准色谱图

腺苷样品色谱图

腺苷样品色谱图

腺苷样标准曲线

腺苷样标准曲线

5.结果计算

X=(V×c)/m

式中x——样品中腺苷含量(μg/g或μg/ml);

V——样品提取液体积(ml);

c——测定液中腺苷浓度(从标准曲线上查得)(μg/ml);

m——样品质量(g)。

6.准确度与精密度

在不同样品中,做不同浓度的加标回收试验,每个浓度6个平行样,回收率为94.7%~96.2%;在同一样品中10次测定结果的相对标准偏差为3.2%。

7.注释

(1)腺苷是一种广泛存在于一些中草药(如冬虫夏草、灵芝、贝母)中的成分,具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心律紊乱等作用。

(2)腺苷在冬虫夏草中也叫虫草素,它是腺嘌呤与3一去氧核糖形成的苷,具有抗病毒、抗菌、抑制肿瘤等活性。

(3)腺苷的配糖体的羟基极性较大,在醇中溶解度较大,可用含水乙醇提取,若样品组分复杂,干扰因素多,可用硅胶柱净化,90%乙醇洗脱,使腺苷和干扰组分得到很好分离。

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