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胆甾醇(胆固醇)的高效液相色谱测定法

2013-10-09    分类:检测方法    0人评论

本方法适用于食品中胆甾醇的测定。
本方法胆甾醇的检出限为93ng。

1.方法

提要样品中胆甾醇用适当有机溶剂提取,得到胆甾醇和脂类物质的混合物,经皂化后除去脂类干扰物,再用适当的有机溶剂提取胆甾醇,以高效液相色谱仪测定,与标准的保留时间比较定性,以外标法定量。

2.仪器

(1)高效液相色谱仪,二极管阵列检测器。
(2)恒温水浴锅。
(3)超声波提取器。
(4)Turbo Vap 500浓缩仪(美国Zymark公司)。

3.试剂

所用试剂除特殊标明外,均为分析纯;实验用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。
(1)氢氧化钾溶液(500g/L):称取50g氢氧化钾,加水溶解并稀释至lOOml。
(2)氯化钠溶液(50g/L):称取5g氯化钠,加水溶解并稀释至100ml。
(3)胆甾醇标准溶液:准确称取5.0mg胆甾醇标准品,加优级纯甲醇溶解,并定容至10ml,混匀后置冰箱保存。此溶液每1ml含胆甾醇0.50mg。
(4)溶剂:甲醇、三氯甲烷、乙醚、乙腈、无水乙醇、石油醚。
(5)元水硫酸钠。

4.测定步骤

(1)样品处理
1)固体样品:准确称取粉碎并混合均匀的样品5.Og,置于250mi具塞锥形瓶中,加三氯甲烷+甲醇(2+1)混合液100ml,超声波提取45min,用快速滤纸过滤,滤纸及残渣用少量三氯甲烷+甲醇(2+1)混合液洗涤数次,收集滤液和洗液,置于250m1分液漏斗中,用50g/L氯化钠溶液30、30、20ml洗涤3次,弃氯化钠溶液层。三氯甲烷提取液用无水硫酸钠脱水后,转移到Tubo Vap 500浓缩仪低温快速浓缩至1.0ml左右,取出剩余液体置于100ml具塞比色管中,在60~65℃水浴上用氮气吹干,加入无水乙醇20ml、500g/L氢氧化钾溶液5ml,在60~65℃水浴上皂化45min,皂化时不断振摇。皂化完毕后,立即趁热取出塞子,稍冷后加入50g/L氯化钠溶液20ml,混匀后加入30ml乙醚+石油醚(1+1)混合液,振摇提取5min,静置。小心取上清液20ml置于50m1分液漏斗中,加少量水多次洗涤提取液(至洗涤液为中性),提取液用无水硫酸钠脱水,水浴上挥干溶剂,用甲醇定容至1.0ml,混匀后取上清液供高效液相色谱分析。

2)液体样品:准确吸取混合均匀的液体样品50.0ml,置于250m1分液漏斗中,加入浓氨水5.0ml,混匀,加入20ml无水乙醇再混匀,用乙醚+石油醚(1+1)混合液40、20、20ml提取3次,合并提取液,置于100ml具塞比色管中,以下按1)项“在60~65℃水浴上用氮气吹干”起操作。

(2)色谱条件
色谱柱:C18柱。
流动相:乙腈+甲醇(3+2)。
测定波长:205nm。
流速:1.5ml/min。
进样量:10μl。

(3)标准曲线:准确吸取标准溶液1.0ml、2.Oml、3.0ml、4.Oml、5.0ml,置于10ml容量瓶中,用优级纯甲醇稀释至刻度,混匀后,分别取10ml注入高效液相色谱仪中,以外标法绘制标准曲线。标准曲线的点为0.20mg/ml、0.40mg/ml、0.60mg/ml、0.80mg/ml、1.0mg/ml。回归方程Y=1085.22x一329.77,r=0.9999。

(4)样品测定:取供色谱分析的样品溶液10ml,注入高效液相色谱仪,与标准品峰的保留时间比较定性,以外标法定量。胆甾醇标准曲线图见图3-61,胆甾醇标准品色谱图见图3—62,样品色谱图见图3—63。

胆固醇标准曲线

胆固醇标准曲线

胆固醇标准品色谱图

胆固醇标准品色谱图

胆固醇样品(鸡蛋)色谱图

胆固醇样品(鸡蛋)色谱图 

5.结果计算

X=(c×V)/(m×V1)

式中x——样品中胆甾醇含量[斗g/g(ml)];
c——得出的测定样液中胆甾醇的浓度(斗g/ml);
V——样品皂化后胆甾醇提取液总体积(ml);
V1——样品测定液总体积(ml);

m——样品的质量或体积(g或ml)。

6.准确度和精密度

在不同样品中进行不同浓度的加标回收试验,胆甾醇回收率为89.2%~105.7%。重复10次测定结果的RSD为11.2%。

7.注释

(1)甾醇(sterol)是一类广泛存在于自然界的甾体化合物,是饱和或不饱和的仲醇,主要存在于动植物的脂肪中,或以较高级脂肪酸酯的形式存在于动物体内,或以苷的形式存在于植物组织中。来自动物体内的甾醇为动物甾醇如胆甾醇,来自植物的甾醇称为植物甾醇如谷甾醇。

(2)胆甾醇(cholesterol)又称胆固醇,分子式为C27H460,以醇式脂肪酸的形式存在于所有的动物细胞中,尤其是在脑和脊髓中含量最多。人体胆甾醇代谢过程发生障碍造成血液中胆甾醇含量过高,可导致动脉粥样硬化。但胆甾醇为人体合成维生素D的重要物质,人体内应保持一定量。

(3)胆甾醇具有旋光性,白色晶体,易溶于有机溶剂。

(4)本方法所用乙醚不得含有过氧化物。

(5)对于脂肪含量少的样品,可省略脂肪提取步骤,样品直接用氢氧化钾乙醇溶液皂化后再用有机溶剂提取胆甾醇即可。

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